一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种α1‑抗胰蛋白酶的制备方法，涉及蛋白纯化领域，包括以下步骤：制取蛋白抽提液；PEG沉淀，去除沉淀物，收集清液，调整所述清液的PH至7.2‑7.4；将所述清液进行离子交换层析，其中，在所述离子交换层析过程中控制中间产品的上样量。PEG沉淀的条件为：pH为5.6±0.1，浓度为11.5％‑12.5％；离子交换层析的PH为8.5±0.3。本发明专利技术提供的方法，均采用常规设备、试剂和技术，不会引入有风险的添加物和杂质；同时，通过控制纯化效果的参数，蛋白分离度高；通过控制上样的总活性保证了生产工艺的批间稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法
本专利技术涉及蛋白纯化领域，尤其涉及一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法。
技术介绍
α1-AT是α1-抗胰蛋白酶，一种糖蛋白，含糖10％-20％，主要由肝脏合成，广泛分布于正常人血清和体液中。它是血清中最主要的蛋白酶抑制剂，对凝血酶、尿激酶等其他酶也有抑制作用，也是一种急性时相反应蛋白，在炎症性疾病时，α1抗胰蛋白酶可透过毛细血管进入组织液，在炎症局部往往浓度很高，对急性炎症性的发展能起到一定的限制作用。国外公布的α1-AT的纯化提取的技术只是粗步的公布了大致的制作工艺，先抽提，再PEG，再层析。但其中涉及的具体参数，如缓冲液、PH、电导、PEG浓度等，以及如何控制工艺达到稳定生产，均没有公布。国内已发表的相关专利，工艺过程复杂，可能引入的杂质多，甚至可能引入以前少有人用的毒性杂质，安全性存在隐患。即便同样是采取离子交换的方法，已公布专利所用的层析条件，导致目的蛋白与杂质蛋白分离度低，纯化效率低，从而增加了生产成本。现有的α1-AT活性的检测方法耗费试剂，成本高，重复性不好控制，且只能检测较高浓度，对于低于检测限的中间产品无法检测，且不能直接读出数值。再加上国外未公布合理的控制纯化工艺稳定性的方法，有可能出现这种情况：生产出来的产品，质量和回收率的批间差异大。因此，本领域的技术人员致力于开发一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法，能够简单、精确的制造出合格的α1-抗胰蛋白酶产品，在降低了生产成本的同时能够保证产品的质量和回收率，并且能够保证生产工艺的批间稳定性。r>
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何简单、精确地制造α1-抗胰蛋白酶，降低成本的同时并保证产品的质量和回收率以及生产工艺的批间稳定性。为实现上述目的，本专利技术提供了一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法，所述制备方法包括离子交换层析，其中：所述离子交换层析在PH为8.5±0.3的条件下进行；以控制离子交换层析蛋白的上样量来确保层析工艺的有效性和批间稳定性，其中，所述控制离子交换层析蛋白的上样量是指在层析填料装填量不变的情况下，每次层析上样样品中目标蛋白的总活性一致；其中，通过检测所述层析上样样品中含有的α1-抗胰蛋白酶对胰蛋白酶的抑制活性，以保证每次层析上样样品中目标蛋白的总活性一致。在一些实施例中，可选地，在进行所述离子交换层析之前，用聚乙二醇沉淀的方法对蛋白抽提液进行前处理以获得层析前中间产品；所述聚乙二醇沉淀在PH为5.5～5.7的条件下进行。在一些实施例中，可选地，检测所述层析前中间产品中α1-抗胰蛋白酶的活性，包括以下步骤：在所述中间产品的反应体系中加入0.2ml胰蛋白酶来检测所述中间产品中的α1-抗胰蛋白酶的抑制效果，以获得对所述α1-抗胰蛋白酶浓度的检测限；所述胰蛋白酶的蛋白含量通过称重确定，所述胰蛋白酶的浓度为0.06±0.02mg/ml。在一些实施例中，可选地，在所述检测层析前中间产品α1-抗胰蛋白酶的活性之前，还包括将所述中间产品稀释8倍，以排除聚乙二醇对检测结果的干扰。在一些实施例中，可选地，所述检测层析前中间产品α1-抗胰蛋白酶的活性还包括：检测配制好的多个浓度的α1-抗胰蛋白酶国际标准品获得参照体系，其中，所述参照体系为标准线性曲线，横坐标为所述α1-抗胰蛋白酶国际标准品的多个浓度，纵坐标为所述多个浓度对应的吸光值。在一些实施例中，可选地，将所述α1-抗胰蛋白酶国际标准品用超纯水溶解后，储存于-80℃保存。在一些实施例中，可选地，所述离子交换层析的离子交换剂为DEAE或QFF。本专利技术提供的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，在进行所述离子交换层析之前，对蛋白抽提液进行前处理；所述前处理包括聚乙二醇沉淀。所述聚乙二醇沉淀在PH为5.5～5.7的条件下进行，沉淀过程结束后用压滤或离心的方法将沉淀于上清液分离后，回调上清液的PH值为7.2～7.4保存，并取样作为待测中间产品。为了对所述中间产品中所包含的α1-抗胰蛋白酶的活性进行检测，本专利技术还提供了一套检测方法。所使用的活性检测方法，降低了最低检测限，极大程度的扩大了检测范围，并摸索出了标准品的长期储存的方法。使用该方法进行检测，可以降低检测过程中各种试剂的消耗，从而降低了检测成本。因为本方法是利用国际标准品作参照物，可以直接读出产品的活性值。经过系列试验，摸索出对于中间产品合适的稀释倍数，排除了中间产品中PEG对检测结果的干扰，能检测出中间产品活性的真实值。本专利技术提供的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，通过离子交换层析进行，其中，所述离子交换层析在PH为8.5±0.3的条件下进行；控制所述离子交换层析过程中的中间产品的上样量，其中，通过检测所述中间产品的活性后根据上样的总活性确定所述样品的上样体积。本专利技术提供的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，具有以下有益的技术效果：1、制备方法中包括的纯化步骤：PEG沉淀和离子交换层析，均采用常规的设备、试剂和技术，不会引入有风险的添加物和杂质；2、针对每一步纯化工艺，提出了控制纯化效果的参数，使目的蛋白和杂质蛋白分离度高，同时，在生产出同等量合格产品的情况下，所需要的离子交换剂更少，有效的降低了生产成本，并同时保证产品的质量和回收率；3、利用中间产品的总活性来控制上样量，以保证生产工艺的批间稳定性，使得各批生产的产品质量和产率具备一致性；4、使用本专利技术提供的方法制备的产品，纯度高，比活性高，抗原含量低，多聚体含量低，IgA含量低，产品质量高；以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是5ml规格DEAE.FF柱、上样量为20ml时的离子交换层析分离效果图；图2是5ml规格DEAE.FF柱、上样量为40ml时的离子交换层析分离效果图；图3是5ml规格DEAE.FF柱、上样量为80ml时的离子交换层析分离效果图；图4是5ml规格DEAE.FF柱、上样量为150ml时的离子交换层析分离效果图。具体实施方式以下参考说明书附图介绍本专利技术的一个优选实施例，使其
技术实现思路
更加清楚和便于理解。本专利技术可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本专利技术的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。本专利技术提供的α1-AT(α1-抗胰蛋白酶)的制备方法，采用离子交换层析的方法，其中，离子交换层析过程中，通过检测中间产品的活性浓度来控制中间产品的上样量。本专利技术的一个较佳实施例的制备过程为：1，蛋白抽提液经12％PEG(聚乙二醇)沉淀，搅拌半小时，通过压滤获取清液，然后回调清液的PH至7.2-7.4以得到中间产品。经过PEG沉淀处理之后，蛋白抽提液中保留了80％左右的目的蛋白，并去掉了大部分的杂质，使目的蛋白纯度提高了20倍左右，剩下的杂质主要为白蛋白和转铁蛋白等。2，将中间产品稀释8倍，以消除PEG的干扰，然本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括离子交换层析，其中：/n所述离子交换层析在PH为8.5±0.3的条件下进行；/n以控制离子交换层析蛋白的上样量来确保层析工艺的有效性和批间稳定性，其中，所述控制离子交换层析蛋白的上样量是指在层析填料装填量不变的情况下，每次层析上样样品中目标蛋白的总活性一致；/n其中，通过检测所述层析上样样品中含有的α1-抗胰蛋白酶对胰蛋白酶的抑制活性，以保证每次层析上样样品中目标蛋白的总活性一致。/n

【技术特征摘要】
20190617 CN 20191052107041.α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括离子交换层析，其中：
所述离子交换层析在PH为8.5±0.3的条件下进行；
以控制离子交换层析蛋白的上样量来确保层析工艺的有效性和批间稳定性，其中，所述控制离子交换层析蛋白的上样量是指在层析填料装填量不变的情况下，每次层析上样样品中目标蛋白的总活性一致；
其中，通过检测所述层析上样样品中含有的α1-抗胰蛋白酶对胰蛋白酶的抑制活性，以保证每次层析上样样品中目标蛋白的总活性一致。


2.如权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：
在进行所述离子交换层析之前，用聚乙二醇沉淀的方法对蛋白抽提液进行前处理以获得层析前中间产品；所述聚乙二醇沉淀在PH为5.5～5.7的条件下进行。


3.如权利要求2所述的α1-抗胰蛋白酶的制备方法，其特征在于，检测所述层析前中间产品中α1-抗胰蛋白酶的活性，包括以下步骤：
在所述中间产品的反应体系中加入0.2ml胰蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡薇，
申请(专利权)人：国药集团上海血液制品有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31