大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白及其制备和应用，属于分子生物学技术领域，所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂H1基因的重组蛋白的氨基酸如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术利用体外重组表达技术获得了大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1蛋白SmSERPINH1，该蛋白具有显著的抗菌活性，在开发新的抗菌制剂、饲料添加剂等方面具有潜在的应用价值。

Recombinant protein of serine protease inhibitor H1 from Scophthalmus maximus and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白及其制备和应用
本专利技术属于分子生物学
，具体说是一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白及其制备和应用。
技术介绍
SERPINH1又称作HPS47,即热休克蛋白47，是丝氨酸蛋白酶抑制剂H亚家族成员,一般为单一肽链蛋白质，由350-400个氨基酸残基组成，较多时可达到500个，广泛存在于动植物和微生物体内。基因本体(GO)分析发现,SERPINH1基因主要有胶原、mRNA结合、丝氨酸内肽酶抑制剂活性、非折叠蛋白质结合等功能,参与了软骨内软骨细胞骨形成、胶原蛋白生物合成、胶原原纤维构建、内肽酶活性负调节、蛋白质成熟、非折叠蛋白反应等生物过程。有研究发现,SERPINH1与多种纤维化疾病,以及硬皮病、炎症性肠病等自身免疫性疾病的发病相关,但其作用机制还不明确。具有广泛的生物学活性和作用，能调节生物体内许多重要的生命过程，如纤维蛋白溶解、氧化还原、细胞基质重建、血凝、肿瘤抑制、炎症反应和免疫应答等。鱼类生活在水环境中，其与外界环境接触的皮肤、鳃、消化道等重要器官表面都覆着一层黏液。自然状态下鱼类分泌黏液是连续进行的，对鱼类呼吸、维持离子和渗透平衡、繁殖、排泄、防止微生物、毒物、污染物等过程非常重要。许多鱼类黏液除含有肽聚糖酶、溶菌酶等抑菌剂外，还含有其他免疫分子如免疫球蛋白、补体、干扰素、凝集素和卵黄生成素，这些成分构成鱼类抵御病原体入侵的第一道防线，为鱼类提供即时保护，防止鱼类受到病原体的侵害。黏膜组织中除含有大量的黏液细胞外，还含有各种免疫细胞和多种固有免疫成份，黏膜免疫是系统免疫的重要补充，因水环境中存在着各种不利因素，鱼类黏膜的防御机制相对于陆生生物更为复杂。研究鱼类的黏膜免疫机制，发掘功能基因，体外验证这些基因的生理功能和生物学作用，并探索其作用机制，为鱼类抗病遗传育种新标记的开发、新型鱼类疾病防治药物的研制、及环境友好型抗菌保鲜制剂的创制提供新的理论基础和研究方向。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白及其制备和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂的重组蛋白，丝氨酸蛋白酶抑制剂H1(SmSERPINH1)基因的重组蛋白的氨基酸如SEQIDNO.1所示。大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白制备方法：(1)以大菱鲆SmSERPINH1成熟肽编码区为模板，采用带有酶切位点(BamHI、HindIII)的引物P1和P2进行PCR扩增，待用；(2)将PCR扩增产物与pEASY-T1载体通过连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；(3)将连接入大菱鲆SmSERPINH1片段的pEASY-T1载体，以BamHI/HindIII酶切，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收SmSERPINH1目的片段，待用；(4)将(3)中回收的SmSERPINH1目的片段与BamHI/HindIII酶切后的pET-28a载体通过连接酶链接，转化，测序鉴定重组子；(5)将上述构建的载体转入E.coiltransettea(DE3)表达菌株中进行诱导表达，而后纯化、浓缩，即得到具有氨基酸序列为SEQIDNO.1的重组蛋白SmSERPINH1；所述引物P1和P2分别为P1：5’—CGCGGATCCATGGAGGACAGGAAGCTGAG—3’；P2：5’—CCCAAGCTTTAGCTCGTCGCGCATCTTGT—3’。本专利技术还提供所述氨基酸序列为SEQIDNO.1中的重组蛋白SmSERPINH1在抗菌制剂中的应用。所述氨基酸序列为SEQIDNO.1的重组蛋白SmSERPINH1在饲料添加剂中的应用。本专利技术还提供含有所述氨基酸为SEQIDNO.1序列重组蛋白的抗菌剂。本专利技术还提供含有所述氨基酸为SEQIDNO.1序列重组蛋白的饲料添加剂。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术利用体外重组表达技术获得了大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1蛋白SmSERPINH1，该蛋白具有显著的抗菌活性，在开发新的抗菌制剂、饲料添加剂等方面具有潜在的应用价值。附图说明图1为大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1基因重组蛋白抑制金黄色葡萄球菌生长的吸光度图。具体实施方式下面的通过实施例来对本专利技术的技术方案做进一步解释，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。实施例1大菱鲆SmSERPINH1基因编码区的体外原核重组表达，包括下列步骤：1、克隆载体的构建本专利技术中采用的克隆载体为北京全式金生物技术有限公司的pET28a(+)载体。通过PCR技术，使用带有酶切位点(BamHI、HindIII)的基因特异性引物P1和P2扩增大菱鲆SmSERPINH1基因除去信号肽的编码区片段。反应条件为:首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环:94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，35个循环，最后72℃延伸5分钟，4℃保存。将PCR产物纯化回收。回收产物与pEASY-T1载体连接，转化后菌落PCR筛选并测序，提取阳性克隆质粒，完成克隆载体构建。所述引物P1为5’—CGCGGATCCATGGAGGACAGGAAGCTGAG—3’；引物P2为5’—CCCAAGCTTTAGCTCGTCGCGCATCTTGT—3’。2、重组载体的构建将连接入大菱鲆SmSERPINH1片段的pEASY-T1载体和pET-28a载体分别以BamHI/HindIII酶切，酶切产物纯化回收。将酶切回收的大菱鲆SmSERPINH1片段与酶切回收的pET-28a载体通过连接酶连接，转化后菌落PCR筛选并测序，提取阳性克隆质粒，完成重组载体构建。3、重组蛋白的表达以北京全式金生物技术有限公司的E.coiltransettea(DE3)大肠杆菌为重组表达菌株，将上述构建的重组载体转化到宿主菌中，挑取单克隆，提取质粒，测序验证读码框正确。挑取单克隆，接种于5mlLB液体培养基中，37℃恒温震荡培养箱中培养12-16小时，过夜培养，然后将此培养液以体积比1:100的比例接种到200ml新的LB液体培养基中，转移到28℃、150rpm培养至菌液的OD600nm约为0.6时。加入IPTG，使终浓度达到0.5mmol/L，继续培养6小时。4℃，5000rpm离心10分钟，收集菌体，于-20℃冻存备用。取1mL菌液离心，弃去上清后，加入320ul的PBS缓冲液充分重悬菌体，然后在冰浴条件下进行超声波破碎。超声完成后，4℃12000rpm离心5分钟，分别收集上清和沉淀。收集得到的上清、沉淀(用PBS重悬)及超声破碎的菌液各取40ul，加入10ul5×SDSLoadingBuffer，99℃加热10分钟，3000rpm离心后放冰上冷却，SDS-PAGE检测表达产物，本专利技术所重组的蛋白大部分为可溶性蛋白。3、重组蛋白的纯化将上述所得可溶性蛋白采用北京全式金生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂的重组蛋白，其特征在于所述丝氨酸蛋白酶抑制剂H1基因的重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂的重组蛋白，其特征在于所述丝氨酸蛋白酶抑制剂H1基因的重组蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述一种大菱鲆丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的重组蛋白的制备方法：
(1)以大菱鲆SmSERPINH1成熟肽编码区为模板，采用带有酶切位点BamHI、HindIII的引物P1和P2进行PCR扩增，待用；
(2)将PCR扩增产物与pEASY-T1载体通过连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；
(3)将连接入大菱鲆SmSERPINH1片段的pEASY-T1载体，以BamHI/HindIII酶切，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收SmSERPINH1目的片段，待用；
(4)将步骤(3)中回收的SmSERPINH1目的片段与BamHI/HindIII酶切后的pET-28a载体通过连接酶链接，转化，测序鉴定重组子；
(5)...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙志宾，马爱军，朱春月，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37