一种肝素残留量测定方法技术

本发明专利技术公开一种肝素残留量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)准备试剂；(2)制备标准曲线：在多个不同浓度的标准品溶液中：加入抗凝血酶III、孵育，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；加入过量的凝血酶Ⅱa、孵育，该反应过程肝素

【技术实现步骤摘要】
一种肝素残留量测定方法


[0001]本专利技术属于生物学检测
，涉及一种肝素残留量测定方法。

技术介绍

[0002]肝素(Heparin)是一种糖胺聚糖，是被广泛应用的抗凝血药物。肝素的抗凝血功能主要是通过它与抗凝血酶的结合来实现的。肝素与抗凝血酶结合后引起抗凝血酶III发生分子构象变化，可加速AT
Ⅲ‑
凝血酶复合物这一反应达千倍以上，从而增强抗凝血酶的抗凝血活性。
[0003]2015年版《中国药典》三部通则3424采用凝固法测定肝素活性，利用硫酸鱼精蛋白能中和肝素，从而影响反应体系中血浆凝固时间，通过凝固时间及中和的硫酸鱼精蛋白量来测定样品中的肝素含量。此凝固法操作繁琐，耗时费力，最终含量通过两个变量因素(硫酸鱼精蛋白和样品含量https://www.doc88.com/p
‑
0941767769872.html)间接获得，精准性相对较差。
[0004]中国药典四部1208肝素生物测定法是化学药效价检测，利用手工试验步骤，终点判定、量反应平行线法的计算模型进行肝素的效价测定。但其针对的是高浓度的肝素活性检测，要求的肝素含量高，对准确度和精密度要求并不高，目前现有技术中缺少对量值较低的肝素残留量的检测手段。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种能够提高残留量检测的检测限，并且简便、准确、定量限低、重复性高的肝素残留量测定方法。本专利技术的肝素残留量测定方法测试原理为：抗凝血酶III(AT
‑Ⅲ
)与凝血酶(IIa)结合生成AT
‑Ⅲ‑
IIa复合物，肝素(HEP)与抗凝血酶III(AT
‑Ⅲ
)、过量的凝血酶(IIa)三者结合形成生成HEP
‑
AT
‑Ⅲ‑
IIa复合物、以及剩余的凝血酶(IIa)；对剩余的凝血酶(IIa)利用发色底物(S
‑
2238)反应，凝血酶将pNA催化解离，游离的pNA可通过分光光度计或酶标仪检测即可反推得到肝素的残留量。
[0006]如下反应所示：
[0007]抗凝血酶III(AT
‑Ⅲ
)+凝血酶(IIa)
→
AT
‑Ⅲ‑
IIa复合物
[0008]↓
[0009]肝素(HEP)+抗凝血酶III(AT
‑Ⅲ
)+过量的凝血酶(IIa)
→
HEP
‑
AT
‑Ⅲ‑
IIa复合物+剩余的凝血酶(IIa)
[0010]↓
[0011]剩余的凝血酶(IIa)+发色底物(S
‑
2238)
→
pNA(OD405检测)
[0012]更具体的，其中：
[0013]抗凝血酶III(AT
‑
III)是一种人体内非常重要的抗凝性蛋白，AT
‑Ⅲ
是凝血酶及因子
Ⅻ
α、
Ⅺ
α、
Ⅸ
α、
Ⅹ
α等含丝氨酸的蛋白酶的抑制剂。它与凝血酶通过精氨酸
‑
丝氨酸肽键相结合形成AT
Ⅲ‑
凝血酶复合物而使酶灭活。
[0014]肝素(Heparin)可加速AT
Ⅲ‑
凝血酶复合物这一反应达千倍以上，肝素与ATⅢ所含的赖氨酸结合后引起ATⅢ构象改变，使ATⅢ所含的精氨酸残基更易与凝血酶的丝氨酸残基结合形成肝素
‑
ATⅢ凝血酶复合物。
[0015]IIa，即凝血酶，由凝血酶原(Prothrombin，II因子)经蛋白水解活化而来。它在凝血过程中起着非常重要的作用，能够促使纤维蛋白凝块的产生。
[0016]S
‑
2238是凝血酶的发色底物(chromogenic substrates)，为化学合成的小肽，其一端为发色基团(pNA)，凝血酶可将pNA催化解离下来。游离pNA可通过常用的专用设备仪器如分光光度计或酶标仪检测。pNA是在一定时间内按相同的速度逐渐生成，直至凝血酶(IIa)或者发色底物消耗完。检测pNA方式为：记录一定时间内吸光值的变化速率，这种动力学法重复性更好。
[0017]至此，形成本专利技术的测试原理。
[0018]为实现上述目的提供一种肝素残留量测定方法，本专利技术采用了如下的技术方案：
[0019]一种肝素残留量测定方法，包括如下步骤：
[0020](1)试剂的制备
[0021]配制稀释液，pH控制在7.4
‑
8.4；复溶抗凝血酶III；复溶凝血酶IIa；
[0022]复溶发色底物：取发色底物S
‑
2238；
[0023]复溶标准品：取肝素标准品，用稀释液稀释至多个不同浓度；
[0024]样品：用稀释液进行预稀释后直接进样；
[0025](2)制备标准曲线
[0026]a.分别加入多个不同浓度的标准品、孵育；
[0027]b.在各标准品溶液中：
[0028]加入抗凝血酶III、孵育，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
[0029]加入过量的凝血酶Ⅱa、孵育，该反应过程肝素
‑
ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
[0030]加入发色底物，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，在405nm波长处记录反应一段时间内(start time/end time)的吸光度值，然后求出吸光度值的变化速率；
[0031]b.数据处理，以相应的吸光度值变化速率Y对其肝素标准品系列溶液效价单位IU/ml作直线回归，求得直线回归方程；
[0032](3)样品肝素残留量的测试
[0033]a.加入一定量的样品、孵育；
[0034]b.加入抗凝血酶III、孵育，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
[0035]加入过量的凝血酶Ⅱa、孵育，该反应过程肝素
‑
ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
[0036]加入发色底物，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，反应结束后读取吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液中肝素的残留量。
[0037]优选的，配制稀释液：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，氯化钠10.23g，EDTA2.8g，聚乙二醇6000 1.0g，加水800ml使溶解，用盐酸调节pH至8.4，用水稀释至10000ml。
[0038]优选的，复溶抗凝血酶：取抗凝血酶(AT
‑Ⅲ
)加入适量超纯水剧烈振荡30分钟至全部溶解，用稀释液稀释至0.25IU/ml；
[0039]复溶凝血酶IIa：取凝血酶IIa，用稀释液稀释至24IU/ml，该浓度使空白管的吸光值在0.8～1.0左右；
[0040]复溶发色底物：取发色底物S
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝素残留量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)试剂的制备配制稀释液，pH控制在7.4
‑
8.4；复溶抗凝血酶III；复溶凝血酶IIa；复溶发色底物：发色底物采用S
‑
2238；复溶标准品：取肝素标准品，用稀释液稀释至多个不同浓度；样品：用稀释液进行预稀释后直接进样；(2)制备标准曲线a.分别加入多个不同浓度的标准品、孵育；b.在各标准品溶液中：加入抗凝血酶III、孵育，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；加入过量的凝血酶Ⅱa、孵育，该反应过程肝素
‑
ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；加入发色底物，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，在405nm波长处记录反应一段时间内的吸光度值，然后求出吸光度值的变化速率；b.数据处理，以相应的吸光度值变化速率Y对其肝素标准品系列溶液效价单位IU/ml作直线回归，求得直线回归方程；(3)样品肝素残留量的测试a.加入待测试样品、孵育；b.加入抗凝血酶III、孵育，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；加入过量的凝血酶Ⅱa、孵育，该反应过程肝素
‑
ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；加入发色底物，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，反应结束后读取吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液中肝素的残留量。2.根据权利要求1所述的肝素残留量测定方法，其特征在于，试剂的制备中：配制稀释液：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，氯化钠10.23g，EDTA2.8g，聚乙二醇6000 1.0g，加水800ml使溶解，用盐酸调节pH至8.4，用水稀释至10000ml。3.根据权利要求1所述的肝素残留量测定方法，其特征在于，试剂的制备中：复溶抗凝血酶：取抗凝血酶AT
‑Ⅲ
加入适量超纯水剧烈振荡30分钟至全部溶解，用稀释液稀释至0.25IU/ml；复溶凝血酶IIa：取凝血酶IIa，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭蕊，孙振宇，袁辰非，金婵婵，朱引莉，赵菲琼，
申请(专利权)人：国药集团上海血液制品有限公司，
类型：发明
国别省市：