活性MMP-9-结合肽制造技术

本发明专利技术提供了新型肽。这种肽具有SEQ ID NO:18代表的氨基酸序列，并且结合活性蛋白酶，但不结合前体蛋白酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】活性MMP-9-结合肽
本专利技术涉及肽、多核苷酸、载体、细胞、用于产生肽的方法、通过此类方法获得的肽、含有该肽的组合物、含有该肽的药物组合物、用于治疗或预防各种疾病的含有该肽的药物组合物、该肽用于治疗或预防各种疾病的用途、包括施用该肽的步骤的用于治疗各种疾病的方法、用于诊断或测试各种疾病的含有该肽的组合物等。
技术介绍
基质金属蛋白酶9(MMP-9)是一种金属蛋白酶(宗族MA，家族M10)，并且由N-末端前肽、与锌离子配位的酶活性结构域、参与结合底物的II型纤连蛋白结构域和C-末端HPX结构域构成(非专利文献1)。MMP-9作为MMP-9的无活性、前体形式(前-MMP-9)分泌，且然后前-MMP-9通过用蛋白酶诸如MMP-3或纤溶酶切割前肽而转化为MMP-9的活化形式(活性MMP-9)(非专利文献2和3)。活性MMP-9切割许多作为底物的细胞外基质蛋白(诸如IV型胶原蛋白和弹性蛋白)或细胞因子(诸如IL-1β和IL-8)，并且参与许多生理功能，诸如细胞增殖、分化、迁移和凋亡(非专利文献4)。据信，由于组织结构的破坏和细胞功能的失调，MMP-9的过度增强导致各种疾病的发展或恶化。具体而言，已经表明，MMP-9的过度增强深度参与此类疾病的病理生理学，例如，在许多炎性疾病诸如结肠炎中，参与上皮结构和屏障功能的破坏以及炎性反应的连续扩增，同时，在血管疾病诸如脑血管病症和主动脉疾病中，参与血-脑屏障或基底膜的失败以及弹性纤维的破坏。预期抑制过度增强的MMP-9活性的MMP-9抑制剂是作为治疗MMP-9相关疾病的药剂的候选物，并且迄今为止已鉴定出许多MMP-9抑制剂。螯合与MMP-9的酶活性中心配位的锌离子的低分子量化合物具有有效的MMP-9抑制活性。然而，由于MMP家族分子的活性中心的氨基酸序列具有非常高的同源性，因此这些化合物也强烈抑制其他MMP的活性(非专利文献5)。在其中施用此类非选择性MMP-9抑制剂的临床试验中，在肌肉骨骼系统中观察到严重的副作用，因此已经停止此类抑制剂的开发(非专利文献6和7)。当靶向酶活性中心时，使用低分子量抑制剂难以获得MMP-9特异性抑制剂。根据抗体药物产生技术的进步，已经进行尝试以使用抗体分子来获取抑制MMP的抗体。此外，已经报道了一些抑制MMP-9的抗体。然而，结合酶活性中心、同时表现出有效的MMP-9抑制活性的抗体，也表现出MMP-2和MMP-14抑制活性，因此它们不能特异性抑制MMP-9(专利文献1、2和3以及非专利文献8)。此外，结合MMP家族分子之间的低氨基酸序列同源性的区域、同时具有有效的MMP-9特异性抑制活性的抗体，不仅结合活性MMP-9，而且结合非活性的前-MMP-9，因此它们不能特异性结合活性MMP-9(专利文献4、5和6，以及非专利文献9和10)。还报道了不结合前-MMP-9、但确实特异性结合活性MMP-9且特异性抑制MMP-9活性的抗体(专利文献7和8，以及非专利文献11)。然而，除了抗体或其片段以外，不结合前-MMP-9、但确实特异性结合活性MMP-9并抑制MMP-9活性的低分子量蛋白(例如，不含免疫球蛋白可变区的蛋白或肽)是未知的。SPINK2(丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal-2型)是具有三个二硫键的Kazal-样结构域，并且作为胰蛋白酶/顶体蛋白抑制剂发挥功能(非专利文献12)。SPINK2和活性MMP-9-结合活性之间的关系尚未阐明。引文列表专利文献专利文献1：WO2004/087042专利文献2：WO2008/102359专利文献3：WO2011/092700专利文献4：WO2012/027721专利文献5：WO2013/130078专利文献6：WO2013/130905专利文献7：WO2016/023972专利文献8：WO2016/023979非专利文献非专利文献1：NagaseH,等人(1999),JournalofBiologicalChemistry(JBiolChem.),Vol.274,No.31:pp.21491-4非专利文献2：OgataY,等人(1992),JournalofBiologicalChemistry(JBiolChem.),Vol.267,No.6:pp.3581-4非专利文献3：LijnenHR,等人(1998),Blood,Vol.91,No.6:pp.2045-53非专利文献4：VandoorenJ,等人(2013),CriticalReviewsinBiochemistryandMolecularBiology(CritRevBiochemMolBiol.),Vol.48,No.3:pp.222-72非专利文献5：ChengM,等人(2000),JournalofMedicinalChemistry(JMedChem.),Vol.43,No.3:pp.369-80非专利文献6：CoussensLM,等人(2002),Science,Vol.295,No.5564:pp.2387-92非专利文献7：BissettD,等人(2005),JournalofClinicalOncology(JClinOncol.),Vol.23,No.4:pp.842-9非专利文献8：Sela-PasswellN,等人(2011),NatureMedicine(NatMed.),Vol.18,No.1:pp.143-7非专利文献9：MarshallDC,等人(2015),PLoSOne,Vol.10,No.5:e0127063非专利文献10：ApplebyTC,等人(2017),JournalofBiologicalChemistry(JBiolChem.),Vol.292,No.16:pp.6810-20非专利文献11：GoffinL,等人(2016),InflammatoryBowelDisease(InflammBowelDis.),Vol.22,No.9:pp.2041-57非专利文献12：ChenT等人(2009),Proteins,Vol.77,No.1:pp.209-19。专利技术概述技术问题本专利技术的一个目的是提供新型的活性基质金属蛋白酶9(MMP-9)结合肽。问题的解决方案本专利技术主要涉及以下内容。(1)SPINK2突变型肽，其包含由SEQIDNO:18(图32)代表的氨基酸序列，并且结合活性人MMP-9，但不结合前人MMP-9。(2)根据(1)所述的SPINK2突变型肽，其中所述肽结合活性人MMP-9的酶活性结构域。(3)根据(1)或(2)所述的肽，其中所述肽抑制人MMP-9的蛋白酶活性。(4)根据(1)至(3)中任一项所述的肽，其中所述抑制对MMP-9是特异性的。(5)根据(1)至(4)中任一项所述的肽，其中X1是Asp或Gly。(6)根据(1)至(5)中任一项本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SPINK2突变型肽，其包含由SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列，并且结合活性人MMP-9，但不结合前人MMP-9。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170718 JP 2017-1389981.SPINK2突变型肽，其包含由SEQIDNO:18(图32)代表的氨基酸序列，并且结合活性人MMP-9，但不结合前人MMP-9。


2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽结合活性人MMP-9的酶活性结构域。


3.根据权利要求1或2所述的肽，其中所述肽抑制人MMP-9的蛋白酶活性。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽，其中所述抑制对MMP-9是特异性的。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽，其中X1是Asp或Gly。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中X7是Pro，X9是Gln，且X10是Met。


7.根据权利要求6所述的肽，其中X2是Arg、Gln、Gly、Trp或Tyr；X3是Arg、Asp、Gln、Glu、Lys、Met、Ser、Thr或Val；X4是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Gly、Leu、Lys或Val；X5是Ala、Arg、Asn、Gly、Ile、Leu或Lys；X6是Ala、Glu、Gly、Met或Ser；X8是Ala、Leu或Ser；X11是Ala、Gly或Ser；X12是Leu、Phe、Ser或Tyr；且X13是Asn、Asp、Gln、Leu或Lys。


8.根据权利要求7所述的肽，其中X2是Arg或Gln；X3是Arg、Gln、Lys、Thr或Val；X4是Arg、Gly或Val；X5是Arg、Gly、Ile或Lys；X6是Glu或Gly；X8是Ala或Ser；X11是Ala、Gly或Ser；X12是Phe或Tyr；且X13是Asn、Gln或Lys。


9.根据权利要求8所述的肽，其中所述肽包含由SEQIDNO:2至6和8(图16至20和22)中的任一个代表的氨基酸序列。


10.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中X6是Tyr，X8是Gln，且X9是Ser。


11.根据权利要求10所述的肽，其中X2是Arg、Lys、Met或Val；X3是Arg、Gln、Lys或Met；X4是Phe或Tyr；X5是Gln、Glu或Lys；X7是Ala或Gly；X10是Asn或His；X11是Leu、Lys、Met或Val；X12是Phe、Ser或Tyr；且X13是Ala、Asn、Gln或Lys、Gln或Lys。


12.根据权利要求11所述的肽，其中X2是Met或Val；X3是Met；X4是Tyr；X5是Lys；X7是Ala；X10是His；X11是Lys；X12是Ser或Tyr；且X13是Gln或Lys。


13.根据权利要求12所述的肽，其中所述肽包含由SEQIDNO:7(图21)或SEQIDNO:9(图23)代表的氨基酸序列。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的肽，其中所述肽包含具有以下的氨基酸序列：
SEQIDNO:18(图32)代表的氨基酸序列；和
1至3个氨基酸残基或SEQIDNO:19(图33)或SEQIDNO:20(图34)代表的氨基酸序列，其添加至SEQIDNO:18(图32)代表的氨基酸序列的氨基末端侧。


15.根据权利要求1至14中任一项所述的肽，其中所述肽包含具有以下的氨基酸序列：
SEQIDNO:18(图32)代表的氨基酸序列；和
由添加至SEQIDNO:18(图32)代表的氨基酸序列的羧基末端侧的1至6个氨基酸组成的氨基酸序列。


16.根据权利要求1至15中任一项所述的肽，其中所述肽包含由SEQIDNO:2至17(图16至31)中的任一个代表的氨基酸序列。


17.根据权利要求1至16中任一项所述的肽，其中所述肽具有特征在于具有三个二硫键且包括环结构、α-螺旋和β-片层的构象。


18.多核苷酸，其包含编码根据权利要求1至17中任一项所述的肽中含有的氨基酸序列的核苷酸序列。


19.载体，其包含根据权利要求18所述的多核苷酸。


20.细胞，其包含根据权利要求18所述的多核苷酸或根据权利要求19所述的载体，或产生根据权利要求1至17中任一项所述的肽。


21.用于产生SPINK2突变型肽的方法，其包括以下步骤(i)和(ii)：
(i)培养根据权利要求20所述的细胞；和
(ii)从培养物回收SPINK2突变型肽。


22.用于产生根据权利要求1至17中任一项所述的肽的方法，其包括通过化学合成或体外翻译制备所述肽的步骤。


23.通过根据权利要求21或22所述的方法获得的SPINK2突变型肽。


24.缀合物，其包含根据权利要求1至17和23中任一项所述的肽以及与其结合的另一部分。


25.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述缀合物是肽。


26.根据权利要求24或25所述的缀合物，其中所述缀合物包含免疫球蛋白Fc区或其功能片段。


27.用于产生根据权利要求24至26中任一项所述的SPINK2突变型肽缀合物的方法，其包括以下步骤(i)和(ii)：
(i)培养细胞，所述细胞含有具有编码所述缀合物中含有的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸或已经向其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：矢野秀法，西宫大祐，桥本隆二，新津阳一，
申请(专利权)人：第一三共株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP