支架蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种多肽，例如Affimer多肽，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至11、13至15、17至19、21至25、27至28、35至37、39、41、43至44、46至47、49至50、52至53、55至58、63至64、66、68至82、84至85和87至98具有至少80％同一性的氨基酸序列；其特征在于，所述多肽包含相对于SEQ ID NO:1的一个或多个突变，所述一个或多个突变选自以下组成的组：T51L、T51V、M65V、N32G、A59I、L38A、V20I、A40I、L38V、A12I、A12V、I16L、V20L、Q26E、E29M、T31K、N32D、N32H、T34V、T34R、T34D、T34P、A40V、Q42D、T45I、T45V、V48E、V48G、V48A、T51F、T51A、A59L、L67I、(V20I、L38A)、(V20L、L38A)、(V20I、L38V)、(V20L、L38V)、(E29K、K30E、E33K)、(Y54D、T83D、Q86E)、(A59L、G60N、D61G、N62K)、(A59V、D61N、N62K)、(G60N、D61G、N62K)、(G60N、ΔD61、N62G)、ΔD61、(A59L、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、ΔD61)、(G60P、ΔD61、N62P)、(G60P、D61P、N62K)、(G60P、ΔD61、N62G)、(G60P、D61G、N62K)、(D61N、N62K)和(T83D、Q86E)。本发明专利技术还涉及多种方法和核酸。

Scaffold protein

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】支架蛋白专利技术背景WO2009/136182公开了使用D48L和G50S的现有技术支架STM的突变，其被公开为导致在细菌系统中的表达增加(第22页，第12至13行)。WO2009/136182以及WO2006/131749均已先前披露了野生型胱抑素A的V48位点的突变，特别是V48D的突变，其可用于消除结构域切换二聚化(WO2006/131749，第35页，第25行)。在WO2009/136182中已经公开了支架SQT的E78A和L80R的同时突变，以及公开了SQM支架中L82R和T83S的同时突变(WO2009/136182第22至23页的骑缝段)。已公开这些同时的突变对在大肠杆菌中表现出高表达。WO2009/136182公开了修饰的胱抑素A(StefinA)支架蛋白。特别地，该文献中的公开集中于“位置4突变”，其对应于胱抑素A的G4位点或STM的W4位点。特别地，该文献教导了G4R突变体的特殊优点。该文献没有任何关于支架蛋白的热稳定性改变的教导。在该文献的仅一个段落中提及了热稳定性，仅作为可测量的几种性质之一，以评估支架蛋白对于经靶肽变形的抗性(WO2009/136182，第13页，第1段)。WO2006/131749公开了胱抑素A作为支架蛋白的用途，并公开了用于确保支架的生物学中性的几种突变。该文献公开了热稳定性测定法(第32页，第1段)，并显示了关于STM的热稳定性的数据(第35页，第9至12行)。在该文献中仅公开了热稳定性作为可测量的性质，以评估支架蛋白对于经靶肽变形的抗性(参见WO2006/131749，第6至7页的骑缝段)。在该文献中没有关于热稳定性的变化或调制的任何教导。WO2014/125290公开了衍生自植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂的支架蛋白。特别地，该文献公开了三种优选的合成蛋白，如WO2014/125290的SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。该文献公开了通过差示扫描量热法测量其优选支架的热稳定性的测量方法(第48页，第31至32行和图7a)。在该文献的任何地方都没有公开可能影响热稳定性的突变。实际上，专利技术人没有以任何方式评论对于其支架蛋白的热稳定性的影响。他们断言，他们优选的支架的热稳定性“高”，但将其归因于其支架的致密性质：“支架的致密性质比在其他胱抑素或半胱氨酸蛋白酶抑制剂的结构中所看到的更为明显，这似乎有助于其高的热稳定性”(WO2014/125290，第53页，第17至19行)。在该文献中没有关于如何调节或改变热稳定性的教导。而且，该文献中关于突变的唯一讨论是与现有技术的突变有关，或者与使用三聚体插入或缺失以便不产生移码突变的需求有关。该文献的科学重点集中在设计衍生自植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的共有序列上-而没有公开操纵序列以影响热稳定性。
技术实现思路
专利技术人研究了胱抑素A支架蛋白，目的在于改善其特性，例如其热稳定性。基于对蛋白结构和功能的洞察力，他们设计了一系列的变化和替代来改善这些特性。这导致了多种令人惊讶的结果，包括未预测到的异常，例如，其中可能预期蛋白会以某种方式起作用，但是其客观发现与预测相矛盾(例如下文详细讨论的Q42D/E异常)。这项实质性研究和智力努力的结果是全面教导了如何改变胱抑素A蛋白的热稳定性，以及这些热稳定性的变化如何为将其用作支架蛋白带来好处。因此，本专利技术涉及多肽，例如Affimer多肽，其包含与SEQIDNO:1的氨基酸残基1至11、13至15、17至19、21至25、27至28、35至37、39、41、43至44、46至47、49至50、52至53、55至58、63至64、66、68至82、84至85和87至98具有至少80％同一性的氨基酸序列；其特征在于，所述多肽包含相对于SEQIDNO:1的一个或多个突变，所述一个或多个突变选自以下组成的组：T51L、T51V、M65V、N32G、A59I、L38A、V20I、A40I、L38V、A12I、A12V、I16L、V20L、Q26E、E29M、T31K、N32D、N32H、T34V、T34R、T34D、T34P、A40V、Q42D、T45I、T45V、V48E、V48G、V48A、T51F、T51A、A59L、L67I、(V20I、L38A)、(V20L、L38A)、(V20I、L38V)、(V20L、L38V)、(E29K、K30E、E33K)、(Y54D、T83D、Q86E)、(A59L、G60N、D61G、N62K)、(A59V、D61N、N62K)、(G60N、D61G、N62K)、(G60N、ΔD61、N62G)、ΔD61、(A59L、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、ΔD61)、(G60P、ΔD61、N62P)、(G60P、D61P、N62K)、(G60P、ΔD61、N62G)、(G60P、D61G、N62K)、(D61N、N62K)和(T83D、Q86E)。本专利技术涉及多肽，例如Affimer多肽，其包含与SEQIDNO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列；其特征在于，所述多肽包含相对于SEQIDNO:1的一个或多个突变，所述一个或多个突变选自以下组成的组：T51L、T51V、M65V、N32G、A59I、L38A、V20I、A40I、L38V、A12I、A12V、I16L、V20L、Q26E、E29M、T31K、N32D、N32H、T34V、T34R、T34D、T34P、A40V、Q42D、T45I、T45V、V48E、V48G、V48A、T51F、T51A、A59L、L67I、(V20I、L38A)、(V20L、L38A)、(V20I、L38V)、(V20L、L38V)、(E29K、K30E、E33K)、(Y54D、T83D、Q86E)、(A59L、G60N、D61G、N62K)、(A59V、D61N、N62K)、(G60N、D61G、N62K)、(G60N、ΔD61、N62G)、ΔD61、(A59L、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、ΔD61)、(G60P、ΔD61、N62P)、(G60P、D61P、N62K)、(G60P、ΔD61、N62G)、(G60P、D61G、N62K)、(D61N、N62K)和(T83D、Q86E)。本专利技术涉及一种多肽，例如Affimer多肽，其包含与SEQIDNO:1的氨基酸残基1至98具有至少80％同一性的氨基酸序列；其特征在于，所述多肽包含相对于SEQIDNO:1的一个或多个突变，所述一个或多个突变选自以下组成的组：T51L、T51V、M65V、N32G、A59I、L38A、V20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至11、13至15、17至19、21至25、27至28、35至37、39、41、43至44、46至47、49至50、52至53、55至58、63至64、66、68至82、84至85和87至98具有至少80％同一性的氨基酸序列；/n其特征在于，所述多肽包含相对于SEQ ID NO:1的一个或多个突变，所述一个或多个突变选自以下组成的组：/nT51L、T51V、M65V、N32G、A59I、L38A、V20I、A40I、L38V、A12I、A12V、I16L、V20L、Q26E、E29M、T31K、N32D、N32H、T34V、T34R、T34D、T34P、A40V、Q42D、T45I、T45V、V48E、V48G、V48A、T51F、T51A、A59L、L67I、(V20I、L38A)、(V20L、L38A)、(V20I、L38V)、(V20L、L38V)、(E29K、K30E、E33K)、(Y54D、T83D、Q86E)、(A59L、G60N、D61G、N62K)、(A59V、D61N、N62K)、(G60N、D61G、N62K)、(G60N、ΔD61、N62G)、ΔD61、(A59L、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、ΔD61)、(G60P、ΔD61、N62P)、(G60P、D61P、N62K)、(G60P、ΔD61、N62G)、(G60P、D61G、N62K)、(D61N、N62K)和(T83D、Q86E)。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170707 GB 1710973.71.一种多肽，其包含与SEQIDNO:1的氨基酸残基1至11、13至15、17至19、21至25、27至28、35至37、39、41、43至44、46至47、49至50、52至53、55至58、63至64、66、68至82、84至85和87至98具有至少80％同一性的氨基酸序列；
其特征在于，所述多肽包含相对于SEQIDNO:1的一个或多个突变，所述一个或多个突变选自以下组成的组：
T51L、T51V、M65V、N32G、A59I、L38A、V20I、A40I、L38V、A12I、A12V、I16L、V20L、Q26E、E29M、T31K、N32D、N32H、T34V、T34R、T34D、T34P、A40V、Q42D、T45I、T45V、V48E、V48G、V48A、T51F、T51A、A59L、L67I、(V20I、L38A)、(V20L、L38A)、(V20I、L38V)、(V20L、L38V)、(E29K、K30E、E33K)、(Y54D、T83D、Q86E)、(A59L、G60N、D61G、N62K)、(A59V、D61N、N62K)、(G60N、D61G、N62K)、(G60N、ΔD61、N62G)、ΔD61、(A59L、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、ΔD61)、(G60P、ΔD61、N62P)、(G60P、D61P、N62K)、(G60P、ΔD61、N62G)、(G60P、D61G、N62K)、(D61N、N62K)和(T83D、Q86E)。


2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述相对于SEQIDNO:1的一个或多个突变选自以下组成的组：
T51L、T51V、M65V、N32G、A59I、E29M、T34V、T34R、T45I、T45V、T51F、A59L、L67I、(E29K、K30E、E33K)、(A59L、G60N、D61G、N62K)、(A59V、D61N、N62K)、(G60N、D61G、N62K)、(G60N、ΔD61、N62G)、ΔD61、(A59L、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、ΔD61、N62G)和(A59V、ΔD61)；
优选地，其中所述多肽的Tm高于SEQIDNO:1的Tm。


3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述相对于SEQIDNO:1的一个或多个突变选自以下组成的组：
L38A、V20I、A40I、L38V、A12I、A12V、I16L、V20L、Q26E、T31K、N32D、N32H、T34D、T34P、A40V、Q42D、V48E、V48G、V48A、T51A、(V20I、L38A)、(V20L、L38A)、(V20I、L38V)、(V20L、L38V)、(Y54D、T83D、Q86E)、(G60P、ΔD61、N62P)、(G60P、D61P、N62K)、(G60P、ΔD61、N62G)、(G60P、D61G、N62K)、(D61N、N62K)和(T83D、Q86E)；
优选地，其中所述多肽的Tm低于SEQIDNO:1的Tm。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含至少一个异源肽插入物，其中所述异源肽插入物包含相对于SEQIDNO:1在以下任一位置处插入的异源肽：
a)47-<异源肽>-55
b)46-<异源肽>-54
c)46-<异源肽>-50
d)48-<异源肽>-50
e)49-<异源肽>-51
f)50-<异源肽>-52
g)66-<异源肽>-85
h)67-<异源肽>-84
i)70-<异源肽>-74
j)72-<异源肽>-74
k)71-<异源肽>-73
l)72-<异源肽>-81
m)73-<异源肽>-80
n)79-<异源肽>-81
o)80-<异源肽>-81
p)82-<异源肽>-83
q)72-<异源肽>-77
r)73-<异源肽>-78
s)74-<异源肽>-79
t)4-<异源肽>-5。


5.根据权利要求4所述的多肽，其中所述多肽包含两个异源肽插入物，第一异源肽插入物位于位置(a)至(f)中的任意一个；并且第二异源肽插入物位于位置(g)至(s)中的任意一个。


6.根据权利要求4所述的多肽，其中所述多肽包含两个异源肽插入物，第一异源肽插入物位于位置(a)至(f)中的任意一个；并且第二异源肽插入物位于位置(t)。


7.根据权利要求4所述的多肽，其中所述多肽包含两个异源肽插入物，第一异源肽插入物位于位置(g)至(s)中的任意一个；并且第二异源肽插入物位于位置(t)。


8.根据权利要求4所述的多肽，其中所述多肽包含三个异源肽插入物，第一异源肽插入物位于位置(a)至(f)中的任意一个；第二异源肽插入物位于位置(g)至(s)中的任意一个；并且第三异源肽插入物位于位置(t)。


9.一种多肽，其包含与SEQIDNO:1的氨基酸残基1至11、13至15、17至19、21至25、27至28、35至37、39、41、43至44、46至47、49至50、52至53、55至58、63至64、66、68至82、84至85和87至98具有至少80％同一性的氨基酸序列；其中所述多肽包含至少一个异源肽插入物；
其特征在于，所述多肽包含相对于SEQIDNO:1的一个或多个突变，所述一个或多个突变选自以下组成的组：
M65I、T51I、T51L、T51V、M65V、A59V、N32G、A59I、L38A、V20A、V20I、A40I、L38V、G50S、L38F、A12I、A12V、I16L、V20L、Q26E、E29M、T31K、N32D、N32H、T34V、T34R、T34K、T34D、T34P、A40V、Q42E、Q42D、T45I、T45V、V48E、V48D、V48G、V48A、V48L、T51F、T51A、A59L、K63R、L67I、N90T、(V20I、L38A)、(V20L、L38A)、(V20I、L38V)、(V20L、L38V)、(E29K、K30E、E33K)、(Y54D、T83D、Q86E)、(A59L、G60N、D61G、N62K)、(A59V、D61N、N62K)、(G60N、D61G、N62K)、(G60N、ΔD61、N62G)、ΔD61、(A59L、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、ΔD61)、(G60P、ΔD61、N62P)、(G60P、D61P、N62K)、(G60P、ΔD61、N62G)、(G60P、D61G、N62K)、(D61N、N62K)和(T83D、Q86E)；
其中所述异源肽插入物包含相对于SEQIDNO:1在以下任一位置处插入的异源肽：
d)48-<异源肽>-50；
e)49-<异源肽>-51；
f)50-<异源肽>-52；
q)72-<异源肽>-77；
r)73-<异源肽>-78；或者
s)74-<异源肽>-79。


10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述多肽包含两个异源肽插入物，第一异源肽插入物位于位置(d)至(f)中的任意一个；并且第二异源肽插入物位于位置(q)至(s)中的任意一个。


11.根据权利要求9所述的多肽，其中所述相对于SEQIDNO:1的一个或多个突变选自以下组成的组：
M65I、T51I、T51L、T51V、M65V、A59V、N32G、A59I、E29M、T34V、T34R、T34K、Q42E、T45I、T45V、T51F、A59L、K63R、L67I、N90T、(E29K、K30E、E33K)、(A59L、G60N、D61G、N62K)、(A59V、D61N、N62K)、(G60N、D61G、N62K)、(G60N、ΔD61、N62G)、ΔD61、(A59L、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、D61G、N62K)、(A59I、G60N、ΔD61、N62G)、(A59V、G60N、ΔD61、N62G)和(A59V、ΔD61)；
优选地，其中所述多肽的Tm高于SEQIDNO:1的Tm。


12.根据权利要求9所述的多肽，其中所述相对于SEQIDNO:1的一个或多个突变选自以下组成的组：
L38A、V20A、V20...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰夫·威廉·普拉特，格雷厄姆·罗伯特·派伊史密斯·斯彭斯，
申请(专利权)人：阿瓦克塔生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB