一种大规模回收线性化质粒的方法技术

本发明专利技术公开了一种大规模回收线性化质粒的方法，包括如下步骤：步骤1，限制性内切酶酶切，线性化质粒在酶切体系中的浓度为0.6～1.7μg/μl，限制性内切酶为PvuI酶，用量为每1μg质粒使用0.2～0.4μl的PvuI酶进行酶切；步骤2，酚氯仿异丙醇抽提；步骤3，醇沉获得线性化质粒。本发明专利技术酶切体系，以PvuI酶酶切，并控制酶切体系中线性化质粒浓度0.6～1.7μg/μl，辅以酚氯仿异丙醇抽提和醇沉，将线性化质粒的回收率提高至92％以上，甚至超过95％，将传统的质粒回收率至少提高30％。此外，本发明专利技术的质粒回收方法适用于大规模质粒回收。

【技术实现步骤摘要】
一种大规模回收线性化质粒的方法
本专利技术属于生物
，涉及质粒回收技术，具体为一种大规模回收线性化质粒的方法。
技术介绍
现有技术中，线性化制粒回收方法主要过程为限制性内切酶酶切，酚氯仿异丙醇抽提，醇沉，过程中需要控制实验的体系及质粒的浓度，其中质粒需保持在较高的浓度，因此需控制酶切体系保持在较小的体积，一般限制性内切酶体系为NEB公司推荐的体系，酶切体系的质粒浓度较低，回收率仅为60～70％。传统的回收方法还有试剂盒回收，但试剂盒回收的话是针对微量的DNA的回收，回收柱的载体不超过20μg。另外PCR清洁试剂盒也可回收分子量在100bp-10kb左右的DNA，最高回收率可达95％，但均针对回收量在10ug以内的微量回收，对于大于10ug的回收无法保证回收率和回收量。
技术实现思路
为了克服上述现有技术中的问题，本专利技术提供一种大规模回收线性化质粒的方法。为了实现本专利技术目的，所采用的技术方案为：一种大规模回收线性化质粒的方法，：包括如下步骤：步骤1，PvuI限制性内切酶酶切，线性化质粒在酶切体系中的浓度为0.6～1.7μg/μl，PvuI限制性内切酶的用量为每1μg质粒使用0.2～0.4μl的PvuI酶进行酶切；步骤2，酚氯仿异丙醇抽提；步骤3，醇沉获得线性化质粒。具体的，述酚氯仿异丙醇抽提包括如下步骤：1)酶切结束后，向酶切体系中加入等体积的酚、氯仿及异丙醇的混合溶液，充分混匀；酚、氯仿及异丙醇的体积比为25:24:1；2)于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；3)向剩余有机相中加入ddH2O，充分混匀；ddH2O的用量一般与酶切体积相等；4)再于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；5)将步骤2)的上层水相和步骤4)的上层水相混合。具体的，述醇沉方法为：首先，向步骤5)中混合后的水相中加入1/10溶液体积的3mol/L的NaAC溶液，混匀；再加入2.5倍溶液体积的无水乙醇，混匀，可见白色絮状物；再于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；向沉淀中加入1/2离心管体积的75％的乙醇，洗涤，然后于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；将沉淀置于超净台内晾干，再加ddH2O溶解。与现有技术相比，本申请取得了如下技术效果：本专利技术酶切体系，以PvuI限制性内切酶进行酶切，并控制酶切体系中线性化质粒浓度0.6～1.7μg/μl，辅以酚氯仿异丙醇抽提和醇沉，将线性化质粒的回收率提高至92％以上，甚至超过95％，将传统的质粒回收率至少提高30％。此外，本专利技术的质粒回收方法实现了大规模质粒回收，比如1mg质粒回收，甚至是1mg以上的质粒回收。具体实施方式本专利技术下面结合实施例作进一步详述：以下实施例中PvuI限制性内切酶为NEB公司(NEWENGLANDBioLabsinc)生产。实施例1：一种大规模回收线性化质粒的方法，包括如下步骤：步骤1，限制性内切酶酶切酶切体系如下：其中线性化质粒为HX-pEmGS-LC-HC(常州艾米能斯生物科技有限公司构建)，浓度1.7ug/uL。步骤2，酚氯仿异丙醇抽提1)酶切结束后，向酶切体系中加入等体积的酚、氯仿及异丙醇的混合溶液，充分混匀；酚、氯仿及异丙醇的体积比为25:24:1；2)于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；3)向剩余有机相中加入约100～200uLddH2O，充分混匀；4)再于4℃，12000rpm离心10min，取上层水相；5)将步骤2)的上层水相和步骤4)的上层水相混合步骤3，醇沉向步骤5)中混合后的水相中加入1/10溶液体积的3mol/L的NaAC溶液，混匀；再加入2.5倍溶液体积的无水乙醇，混匀，可见白色絮状物；再于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；向沉淀中加入1/2离心管体积的75％的乙醇，洗涤，然后于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液；将沉淀置于超净台内晾干，再加ddH2O溶解。实施例2除了限制性内切酶酶切体系，其余步骤与实施例1相同，本实施例的限制性内切酶酶切体系如下：其中线性化质粒为HX-pEmGS-LC-HC(常州艾米能斯生物科技有限公司构建)，浓度1.663μg/μL实施例3其中线性化质粒为HX-pEmGS-LC-HC(常州艾米能斯生物科技有限公司构建)，浓度1.124ug/uL实施例4其中线性化质粒为HX-pEmGS-LC-HC(常州艾米能斯生物科技有限公司构建)，浓度2.721ug/uL实施例5其中线性化质粒为HX-pEmGS-LC-HC(常州艾米能斯生物科技有限公司构建)，浓度1.61ug/uL对比实施例1传统的质粒回收方法除限制性内切酶酶切体系和酶切方法，其余与实施例1相同，限制性内切酶体系为NEB推荐体系，具体如下：上述实施例1至5及对比实施例1中的质粒回收方法，各实施例获得的质粒回收情况见表1:表1表中可以看出本专利技术的线性化质粒回收率高达92％以上，且回收的线性化质粒均合格，一般回收的线性化质粒浓度在1ug/mL即1000ng/uL左右，OD260/230在1.8～2.0，OD260/280>2即为合格(回收的DNA的浓度及质量确认合格后，方可用于细胞转染)。以上所述，仅为本专利技术较佳的具体实施方式，但本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术揭露的技术范围内，根据本专利技术的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大规模回收线性化质粒的方法，其特征在于：包括如下步骤：/n步骤1，PvuI限制性内切酶酶切，线性化质粒在酶切体系中的浓度为0.6～1.7μg/μl，限制性内切酶PvuI的用量为每1μg质粒使用0.2～0.4μl的PvuI限制性内切酶进行酶切；/n步骤2，酚氯仿异丙醇抽提；/n步骤3，醇沉获得线性化质粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种大规模回收线性化质粒的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1，PvuI限制性内切酶酶切，线性化质粒在酶切体系中的浓度为0.6～1.7μg/μl，限制性内切酶PvuI的用量为每1μg质粒使用0.2～0.4μl的PvuI限制性内切酶进行酶切；
步骤2，酚氯仿异丙醇抽提；
步骤3，醇沉获得线性化质粒。


2.根据权利要求1所述的大规模回收线性化质粒的方法，其特征在于：所述酚氯仿异丙醇抽提包括如下步骤：
1)酶切结束后，向酶切体系中加入等体积的酚、氯仿及异丙醇的混合溶液，充分混匀；酚、氯仿及异丙醇的体积比为25:24:1；
2)于4℃，12000rpm离心10min，取上...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔维娟，宋彦凌，董庸行，
申请(专利权)人：常州艾米能斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32