【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于克鲁维酵母宿主细胞基因组整合的方法1.相关申请的交叉引用本申请要求2017年9月18日提交的美国临时申请序列号62/560,029和2018年5月4日提交的美国临时申请序列号62/667,000的优先权，通过引用其全部内容将其纳入本文。2.联邦资助的研究与开发下作出专利技术的权利声明本专利技术得到DARPA授予的HR0011-15-3-0001协议下由政府支持所完成。政府对本专利技术享有某些权利。3.专利
本文所提供的方法和组合物通常涉及分子生物学和遗传工程改造领域。4.
技术介绍
遗传工程改造技术将靶向修饰引入宿主细胞基因组能够用于各种领域。根本地，确定基因型如何影响表型取决于引入靶向插入或缺失以削弱或废除天然基因功能的能力。在合成生物学领域，制造能够产生感兴趣的化合物或蛋白质的遗传修饰的微生物需要将定制的DNA序列插入宿主细胞的染色体中；工业规模生产通常需要在宿主细胞基因组中引入多个基因。对于某些宿主细胞，特别是对于常规酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomycescer...
【技术保护点】
1.一种修饰克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主细胞基因组中靶位点的方法，所述方法包括：/n(a)使具有降低的非同源末端连接(NHEJ)活性的宿主细胞接触：/n(i)第一线性核酸，其能够与其自身或与所述宿主细胞所接触的一种或多种其他线性核酸同源重组，从而所述宿主细胞中的同源重组导致环状染色体外核酸的形成，所述环状染色体外核酸包含选择性标志物的编码序列和稳定元件，所述稳定元件包含与SEQ ID NO:2至少95％相同的着丝粒序列(CEN)序列和与SEQ ID NO:3至少90％相同的自主复制序列(ARS)共有序列；/n(ii)能够切割所述靶位点的核酸酶；和/n(iii...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170918 US 62/560,029;20180504 US 62/667,0001.一种修饰克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主细胞基因组中靶位点的方法，所述方法包括：
(a)使具有降低的非同源末端连接(NHEJ)活性的宿主细胞接触：
(i)第一线性核酸，其能够与其自身或与所述宿主细胞所接触的一种或多种其他线性核酸同源重组，从而所述宿主细胞中的同源重组导致环状染色体外核酸的形成，所述环状染色体外核酸包含选择性标志物的编码序列和稳定元件，所述稳定元件包含与SEQIDNO:2至少95％相同的着丝粒序列(CEN)序列和与SEQIDNO:3至少90％相同的自主复制序列(ARS)共有序列；
(ii)能够切割所述靶位点的核酸酶；和
(iii)能够在切割的靶位点处同源重组的供体DNA分子，从而所述宿主细胞中的同源重组导致供体线性核酸在所述靶位点处整合；和
(b)选择表达所述选择性标志物的转化宿主细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述稳定元件与长度小于750bp且包含SEQIDNO:1残基202-876的序列至少90％相同。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述稳定元件与SEQIDNO：1至少95％相同。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述宿主细胞是马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述接触步骤包括使所述宿主细胞与能够与所述宿主细胞基因组中不同靶位点同源重组的两种或更多种供体DNA分子接触，从而所述宿主细胞中的同源重组导致所述供体DNA分子在不同的靶位点处整合。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括回收其中所述供体DNA分子已经同源重组于所述靶位点的宿主细胞。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述环状染色体外核酸还包含所述核酸酶的编码序列。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述核酸酶是RNA引导的DNA内切核酸酶。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述RNA引导的DNA内切核酸酶是Cas9内切核酸酶。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中，所述环状染色体外核酸还包含编码crRNA活性和tracrRNA活性的序列，其能够通过所述RNA引导的DNA核酸酶实现所述靶位点的位点特异性识别和切割。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述crRNA活性和tracrRNA活性表达为单个连续RNA分子。
12.如权利要求8-11所述的方法，其中，在使所述宿主细胞与编码crRNA活性和tracrRNA活性的序列接触之前，将编码所述RNA引导的DNA内切核酸酶的核酸预整合到所述宿主细胞基因组中。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述NHEJ通过在YK...
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