一种快速制备单分子光学图谱标记文库的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种快速制备单分子光学图谱标记文库的方法，包括以下步骤：(1)提取长片段基因组DNA；(2)标记提取的基因组DNA；(3)纯化标记的基因组DNA，和(4)将基因组DNA的骨架染色，获得单分子光学图谱标记文库。本发明专利技术还涉及用于制备单分子光学图谱标记文库的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种快速制备单分子光学图谱标记文库的方法和试剂盒
本专利技术涉及一种快速制备单分子光学图谱标记文库的方法，以及适用于此方法的试剂盒。
技术介绍
人类许多疾病是由于染色体结构变异引起的。现在常用的染色体结构分析的方法有核型分析、芯片杂交等。然而，这些技术均存在一定局限性，比如分辨率低、成本高、不能覆盖全基因组等。长片段单分子光学图谱技术的发展弥补了上述技术的局限。BioNano公司推出的Irys和Saphyr系统利用限制性切刻酶或甲基化转移酶对DNA进行识别并标记荧光1，再利用纳米通道把DNA单分子线性化展开，并进行超长单分子高分辨率荧光成像，即可生成一幅特异酶位点分布图。单分子光学图谱技术可以辅助基因组组装、检测染色体结构变异和基因遗传病的检测2。然而，现阶段的单分子光学图谱标记文库的制备存在耗时长、制备过程繁琐等缺点，并不适用于临床检测。此外，光学图谱技术的优势是可以在单分子水平上标记DNA，因此基因组DNA片段的长度是决定光学图谱标记效果的重要因素之一。一般要求DNA片段的平均长度大于200Kb，最长的DNA片段达到Mb级别。目前一般采用基于低熔点琼脂糖凝胶包埋的固相方法获得用于制备光学图谱标记文库的长片段基因组DNA3-6。该方法可提取长达Mb级别的高纯度基因组DNA，但是包括将细胞包埋成琼脂糖胶块、蛋白酶K消化处理、胶块熔解、胶块酶解和基因组DNA透析等步骤，操作过程非常繁琐，耗时超过24小时。并且，这种方法提取的长片段基因组DNA产率往往不稳定，非常黏稠，均一性差导致难以测度浓度，从而影响后续光学图谱标记的质量。这种固相长片段基因组DNA提取加上BioNano公司的直接标记染色(DirectLabelingandStaining，DLS)，使得制备光学图谱标记文库总共需要长达3.5天的时间。这些因素都不利于光学图谱技术的大规模推广使用。为解决以上问题，本专利技术提供了一种基于液相系统的快速制备光学图谱标记文库的方法，仅包含提取长片段基因组DNA、标记基因组DNA、纯化标记的基因组DNA和将基因组DNA染色四个步骤。该方法简化了光学图谱标记的流程，将时间由原来的3.5天缩短为8小时，并且最终获得的标记文库质量较高，重复性强，有利于单分子光学图谱技术在临床检测上的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现阶段单分子光学图谱文库制备耗时长、过程繁琐等问题。通过液相提取长片段基因组DNA并简化单分子光学图谱标记流程，本专利技术能够实现快速单分子光学图谱标记文库的快速制备。因此，第一个方面，本专利技术提供一种快速制备单分子光学图谱标记文库的方法，包括以下步骤：(1)提取长片段基因组DNA；(2)标记提取的基因组DNA；(3)纯化标记的基因组DNA，和(4)将基因组DNA的骨架染色，获得单分子光学图谱标记文库。在一个实施方案中，提取长片段基因组DNA的步骤包括细胞裂解、基因组DNA沉淀、基因组DNA清洗和基因组DNA溶解。在一个优选的实施方案中，提取长片段基因组DNA的步骤包括以下子步骤：a)向样品中加入裂解液和蛋白酶K，使细胞裂解并释放基因组DNA；b)向步骤a)的反应体系中加入沉淀剂，获得基因组DNA的沉淀；c)用清洗液洗涤所得的基因组DNA的沉淀；d)用溶解液溶解基因组DNA。在一个优选的实施方案中，提取长片段基因组DNA的步骤由以上四个子步骤a)-d)组成。在本文中，“长片段基因组DNA”是指平均长度大于200Kb，且最长可达Mb级别的基因组DNA。在一个实施方案中，样品可以是动物来源的任何组织或细胞，例如来自胚胎组织、肝脏组织、胸腺组织、脾脏组织、体液的细胞，或体外培养的细胞系等。体液的实例包括但不限于血液、血清、血浆、关节液、精液、尿液、汗液、唾液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁、胰腺液等。在一个实施方案中，裂解液包含NaCl、Tris-HCl(pH7.4-8.0)、EDTA(pH8.0)和SDS。在另一个实施方案中，裂解液由NaCl、Tris-HCl(pH7.4-8.0)、EDTA(pH8.0)和SDS组成。裂解液中NaCl、Tris-HCl(pH7.4-8.0)和EDTA(pH8.0)的浓度可以根据具体实验要求通过常规实验进行调整和确定，例如，NaCl的浓度为0.1M-0.5M，Tris-HCl(pH7.4-8.0)的浓度为10mM-200mM，EDTA(pH8.0)的浓度为10mM-100mM。但是，SDS的浓度对提取的基因组DNA的质量非常关键。具体而言，SDS的浓度过低，例如低于0.1％，则会导致细胞裂解不充分；SDS的浓度过高，例如高于8％，则过量的SDS会随着基因组DNA沉淀，影响后续实验。因此，在本专利技术中，SDS的浓度优选为0.1％-8％，更优选0.1％-5％。在一个实施方案中，裂解液还可以包含RNaseA，其作用是除去系统中的RNA杂质。RNaseA的含量可以由本领域技术人员根据需要确定，例如为20μg/ml。在一个实施方案中，蛋白酶K的终浓度为0.005-4mg/ml，优选0.005-2.5mg/ml。蛋白酶K的作用在于降解膜蛋白和与基因组DNA结合的蛋白质，从而使基因组DNA充分游离。当蛋白酶K的含量过低，例如低于0.005mg/ml，则不能充分降解膜蛋白和基因组DNA结合的蛋白质，可能会影响基因组DNA后续应用，例如影响基因组DNA的BioNano光学图谱标记；当蛋白酶K的含量过高，例如高于4mg/ml，则过量的蛋白酶K随着基因组DNA沉淀，会降解后续应用中的酶切体系，例如影响基因组DNA的BioNano光学图谱标记。在一个实施方案中，蛋白酶K和裂解液可以依次加入，也可以同时加入。上述步骤a)的处理时间和温度可以由本领域技术人员根据实验需求进行调整和确定。例如，可以在30-65℃的温度下处理1-2小时。在一个实施方案中，本专利技术的沉淀剂包含至少一种无机盐和至少一种醇类。在另一个实施方案中，本专利技术的沉淀剂由无机盐和醇类组成。在本专利技术的方法中，无机盐的实例包括但不限于醋酸铵、醋酸钠、氯化钠、氯化锂等；醇类的实例包括但不限于无水乙醇、异丙醇等。在本专利技术中适用于沉淀基因组DNA的无机盐的浓度为300-500mM，优选350-450mM，更优选约450mM，醇类的浓度为50-80％，更优选60-70％，更优选约65％。上述步骤b)的沉淀时间可以由本领域技术人员根据实验需求进行调整和确定。在一个实施方案中，清洗液包含70％-80％乙醇。在另一个实施方案中，清洗液由70％-80％乙醇组成。在一个实施方案中，溶解液选自去离子水、Tris-HCl、TE缓冲液等。其他已知的可以用于溶解基因组DNA的溶液也适用于本专利技术。在一个实施方案中，在标记酶存在下用染料对提取的基因组DNA进行标记。具体地，标记酶可以是商品化或纯化的限制性切刻酶或甲基化转移酶。染料可以选自BODIPY、FITC、罗丹明、香豆素、呫吨、花青素、芘和酞菁。对提取的基因组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速制备单分子光学图谱标记文库的方法，包括以下步骤：/n(1)提取长片段基因组DNA；/n(2)标记提取的基因组DNA；/n(3)纯化标记的基因组DNA，和/n(4)将基因组DNA的骨架染色，获得单分子光学图谱标记文库。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速制备单分子光学图谱标记文库的方法，包括以下步骤：
(1)提取长片段基因组DNA；
(2)标记提取的基因组DNA；
(3)纯化标记的基因组DNA，和
(4)将基因组DNA的骨架染色，获得单分子光学图谱标记文库。


2.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)进一步包括以下子步骤：
a)向样品中加入裂解液和蛋白酶K，使细胞裂解并释放基因组DNA；
b)向步骤a)的反应体系中加入沉淀剂，获得基因组DNA的沉淀；
c)用清洗液洗涤所得的基因组DNA的沉淀；
d)用溶解液溶解基因组DNA。


3.权利要求1或2所述的方法，其中步骤(1)在单反应管中进行。


4.权利要求2所述的方法，其中所述裂解液包含NaCl、Tris-HCl、EDTA和SDS。


5.权利要求4所述的方法，其中所述SDS的浓度为0.1％-8％。


6.权利要求2所述的方法，其中所述裂解液包含RNaseA。


7.权利要求2所述的方法，其中所述蛋白酶K的浓度为0.005-4mg/ml。


8.权利要求2所述的方法，其中所述沉淀剂包含至少一种无机盐和至少一种醇类。


9.权利要求2所述的方法，其中所述清洗液包含70％乙醇。


10.权利要求2所述的方法，其中所述溶解液选自去离子水、Tris-HCl和TE缓冲液。


11.权利要求1所述的方法，其中步骤(2)包括在标记酶存在下，将染料与步骤(1)提取的基因组DNA一起孵育。


12.权利要求11所述的方法，其中所述标记酶是限制性切刻酶或甲基化转移酶。


13.权利要求11所述的方法，其中所述染料选自BODIPY、FITC、罗丹明、香...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛爱平，张海满，张建光，
申请(专利权)人：北京贝瑞和康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11