用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物技术方案

本发明专利技术提供了用于靶向和编辑核酸的系统、方法和组合物。特别地，本发明专利技术提供了非天然存在的或工程化的DNA靶向系统，所述系统包含DNA靶向Cpf1蛋白、至少一种指导分子和至少一种腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物相关申请及以引用方式并入本申请要求2017年5月18日提交的美国临时申请号62/508,293、2017年9月21日提交的美国临时申请号62/561,663、2017年10月4日提交的美国临时申请号62/568,133和2017年12月22日提交的美国临时申请号62/609,957的优先权，所述临时申请各自以引用方式整体并入本文。关于联邦资助研究的声明本专利技术是根据由美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的授权号MH100706和MH110049在政府支持下完成的。政府享有本专利技术的某些权利。专利
本专利技术总体上涉及用于靶向和编辑核酸，特别地用于目标靶基因座处腺嘌呤的可编程脱氨的系统、方法和组合物。
技术介绍
在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术是通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的系统性逆向工程化成为可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用所需要的。虽然基因组编辑技术，如设计师锌指、转录激活因子样效应子(TALE)、或归巢大范围核酸酶(homingmeganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要采用新颖的策略和分子机制且是负担得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基因组工程化技术。这将为基因组工程化和生物技术的新应用提供主要资源。先前已经报道了胞嘧啶的可编程脱氨，其可用于校正A→G和T→C点突变。例如，Komor等人，Nature(2016)533：420-424报道了在非靶向DNA链中通过APOBEC1胞嘧啶脱氨酶进行的胞嘧啶脱氨，Cas9-指导RNA复合物与靶向DNA链的结合导致该非靶向DNA移位，从而使得胞嘧啶转化为尿嘧啶。另参见Kim等人，NatureBiotechnology(2017)35：371-376；Shimatani等人，NatureBiotechnology(2017)doi：10.1038/nbt.3833；Zong等人，NatureBiotechnology(2017)doi：10.1038/nbt.3811；YangNatureCommunication(2016)doi：10.1038/ncomms13330。然而，A→G和T→C点突变仅代表已知病原性SNP的约12％，而G→A和C→T点突变代表已知病原性SNP的约47％，并且不能通过胞嘧啶脱氨来寻址。需要新颖的系统和方法来校正这些点突变和病原性SNP。
技术实现思路
本专利技术的至少第一方面涉及一种修饰目标靶基因座中的腺嘌呤的方法，所述方法包括向所述基因座递送：(a)Cpf1切口酶蛋白；(b)指导分子，所述指导分子包含连接至正向重复序列的指导序列；和(c)腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域；其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域共价或非共价地连接至所述Cpf1切口酶蛋白或所述指导分子，或者适于在递送之后连接至所述Cpf1切口酶蛋白或所述指导分子；其中指导分子与所述Cpf1切口酶蛋白形成复合物并引导所述复合物结合所述目标靶基因座处的第一DNA链，其中所述指导序列能够与所述第一DNA链内包含腺嘌呤的靶序列杂交，以形成包含与所述腺嘌呤相对的非配对胞嘧啶的异源双链体；其中所述Cpf1切口酶蛋白使因所述异源双链体形成而移位的所述目标靶基因座处的第二DNA链产生切口；并且其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域使所述异源双链体中与所述非配对胞嘧啶相对的腺嘌呤脱氨基。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域融合至Cpf1切口酶蛋白的N端或C端。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域通过接头融合至Cpf1切口酶蛋白。在一些实施方案中，接头是(GGGGS)3-11(SEQIDNO：1-9)、GSG5(SEQIDNO：10)或LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTR(SEQIDNO：11)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域连接至衔接蛋白，并且指导分子或Cpf1切口酶蛋白包含能够与衔接蛋白结合的适体序列。在一些实施方案中，衔接序列选自MS2、PP7、Qβ、F2、GA、fr、JP501、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、φCb5、φCb8r、φCb12r、φCb23r、7s和PRR1。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域插入到Cpf1切口酶蛋白的内环中。在一些实施方案中，Cpf1切口酶蛋白是使非靶链，即与包含靶序列并且与指导序列杂交的链互补的链产生切口的切口酶。在一些实施方案中，Cpf1切口酶蛋白包含在Nuc结构域中的突变。在一些实施方案中，Cpf1切口酶蛋白包含对应于AsCpf1中的R1226A的突变。在一些实施方案中，将Cpf1切口酶的部分或全部Nuc结构域去除。在一个具体实施方案中，将AsCpf1的氨基酸1076至1258去除并且替代为接头(例如GSGG或GGSGGS接头)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas蛋白是死亡Cpf1，其包含在RuvC结构域中的突变。在一些实施方案中，CRISPR-Cas蛋白是死亡Cpf1，并且包含对应于AsCpf1中的D908A或E993A的突变。在一些实施方案中，将死亡Cpf1的部分或全部Nuc结构域去除。在一个具体实施方案中，将AsCpf1的氨基酸1076至1258去除并且替代为接头(例如GSGG或GGSGGS接头)。在一些实施方案中，指导分子结合至Cpf1并且能够与靶序列形成约24nt的异源双链体。在一些实施方案中，指导分子结合至Cpf1并且能够与靶序列形成超过24nt的异源双链体。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是人类、鱿鱼或果蝇腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，已对腺苷脱氨酶进行了修饰以增加针对DNA-RNA异源双链体的活性。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶是包含突变E488Q的突变hADAR2d或包含突变E1008Q的突变hADAR1d。在一些实施方案中，所述方法包括确定目标靶序列以及选择最有效地使存在于靶序列中的腺嘌呤脱氨基的腺苷脱氨酶。在一些实施方案中，Cpf1切口酶蛋白来源于选自由以下组成的组的细菌种类：土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、易北普雷沃氏菌(Prevotellaalbensis)、毛螺科菌、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)、异域菌门菌(Peregrinibacteriabacterium)、帕库氏菌(Parcubacteriabacterium)、史密斯氏菌属种(Smithellasp.)、氨基酸球菌属种(Acidaminococcussp.)、毛螺科菌、候选白蚁甲烷支原体(CandidatusMethanoplasmatermi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种修饰目标靶基因座中的腺嘌呤的方法，所述方法包括向所述基因座递送：/n(a)Cpf1切口酶蛋白；/n(b)指导分子，所述指导分子包含连接至正向重复序列的指导序列；和/n(c)腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域；/n其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域共价或非共价地连接至所述Cpf1切口酶蛋白或所述指导分子，或者适于在递送之后连接至所述Cpf1切口酶蛋白或所述指导分子；/n其中指导分子与所述Cpf1切口酶蛋白形成复合物并引导所述复合物结合所述目标靶基因座处的第一DNA链，其中所述指导序列能够与所述第一DNA链内包含所述腺嘌呤的靶序列杂交以形成异源双链体，其中所述指导序列在对应于所述腺嘌呤的位置处包含非配对胞嘧啶，导致在所形成的异源双链体中出现A-C错配；/n其中所述Cpf1切口酶蛋白使因所述异源双链体形成而移位的所述目标靶基因座处的第二DNA链产生切口；并且/n并且其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域使所述异源双链体中的所述腺嘌呤脱氨基。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170518 US 62/508,293;20170921 US 62/561,663;20171.一种修饰目标靶基因座中的腺嘌呤的方法，所述方法包括向所述基因座递送：
(a)Cpf1切口酶蛋白；
(b)指导分子，所述指导分子包含连接至正向重复序列的指导序列；和
(c)腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域；
其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域共价或非共价地连接至所述Cpf1切口酶蛋白或所述指导分子，或者适于在递送之后连接至所述Cpf1切口酶蛋白或所述指导分子；
其中指导分子与所述Cpf1切口酶蛋白形成复合物并引导所述复合物结合所述目标靶基因座处的第一DNA链，其中所述指导序列能够与所述第一DNA链内包含所述腺嘌呤的靶序列杂交以形成异源双链体，其中所述指导序列在对应于所述腺嘌呤的位置处包含非配对胞嘧啶，导致在所形成的异源双链体中出现A-C错配；
其中所述Cpf1切口酶蛋白使因所述异源双链体形成而移位的所述目标靶基因座处的第二DNA链产生切口；并且
并且其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域使所述异源双链体中的所述腺嘌呤脱氨基。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域融合至所述Cpf1切口酶蛋白的N端或C端。


3.如权利要求2所述的方法，其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域通过接头融合至所述Cpf1切口酶蛋白。


4.如权利要求3所述的方法，其中所述接头是(GGGGS)3-11(SEQIDNO：1-9)、GSG5(SEQIDNO：10)或LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTR(SEQIDNO：11)。


5.如权利要求1所述的方法，其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域连接至衔接蛋白，并且所述指导分子或所述Cpf1切口酶蛋白包含能够与所述衔接蛋白结合的适体序列。


6.如权利要求5所述的方法，其中所述衔接序列选自MS2、PP7、Qβ、F2、GA、fr、JP501、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、φCb5、φCb8r、φCb12r、φCb23r、7s和PRR1。


7.如权利要求1所述的方法，其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域插入到所述Cpf1切口酶蛋白的内环中。


8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述Cpf1切口酶蛋白包含在Nuc结构域中的突变。


9.如权利要求8所述的方法，其中所述Cpf1切口酶蛋白包含对应于AsCpf1中的R1226A的突变。


10.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中已将所述Cpf1切口酶蛋白的至少部分所述Nuc结构域去除。


11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述指导分子结合至所述Cpf1切口酶蛋白并且能够与所述靶序列形成约24nt的所述异源双链体。


12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述指导分子结合至所述Cpf1切口酶蛋白并且能够与所述靶序列形成超过24nt的所述异源双链体。


13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域是人类、鱿鱼或果蝇腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域。


14.如权利要求13所述的方法，其中已对所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域进行了修饰以增加针对DNA-RNA异源双链体的活性。


15.如权利要求14所述的方法，其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域是包含突变E488Q的突变hADAR2d或包含突变E1008Q的突变hADAR1d。


16.如权利要求13所述的方法，其中已对所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域进行了修饰以减少脱靶效应。


17.如权利要求16所述的方法，其中所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域是包含突变T375G/S、N473D或两者的突变hADAR2d，或包含相应突变的突变hADAR1d。


18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Cpf1切口酶蛋白和任选地所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域包含一个或多个异源核定位信号(NLS)。


19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定所述目标靶序列以及选择最有效地使存在于所述靶序列中的所述腺嘌呤脱氨基的所述腺苷脱氨酶蛋白或其催化结构域。


20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Cpf1切口酶蛋白获自来源于选自由以下组成的组的细菌种类的Cpf1核酸酶：土拉弗朗西斯菌、易北普雷沃氏菌、毛螺科菌、解蛋白丁酸弧菌、异域菌门菌、帕库氏菌、史密斯氏菌属种、氨基酸球菌属种、毛螺科菌、候选白蚁甲烷支原体、挑剔真杆菌、牛眼莫拉氏菌、稻田氏钩端螺旋体、狗口腔卟啉单胞菌、解糖胨普雷沃氏菌和猕猴卟啉单胞菌、溶糊精琥珀酸弧菌、解糖胨普雷沃氏菌、嗜鳃黄杆菌、孔兹氏创伤球菌、真细菌属种、微基因组菌(罗兹曼菌)、黄杆菌属种、短普雷沃氏菌、山羊莫拉氏菌、口腔拟杆菌、犬嘴卟啉单胞菌、琼氏互养菌、布氏普雷沃氏菌、厌氧弧菌属种、溶纤维丁酸弧菌、候选甲烷嗜甲基菌、丁酸弧菌属种、口腔无芽孢厌氧菌属种、瘤胃假丁酸弧菌和产丁酸菌。


21.如权利要求20所述的方法，其中所述Cpf1切口酶蛋白是FnCpf1切口酶并且识别TTN的PAM序列，其中N是A/C/G或T，或者所述Cpf1切口酶蛋白是PaCpf1p、LbCpf1或AsCpf1切口酶并且识别TTTV的PAM序列，其中V是A/C或G。


22.如权利要求20所述的方法，其中所述Cpf1切口酶蛋白已...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·张，D·B·T·科克斯，J·戈滕贝格，O·O·阿布达耶，B·蔡彻，J·斯特雷克，
申请(专利权)人：博德研究所，麻省理工学院，哈佛学院院长等，
类型：发明
国别省市：美国;US