一种构建人心肌细胞凋亡模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建人心肌细胞凋亡模型的方法。发明专利技术人在研究过程中意外发现，一定浓度之上的血管紧张素Ⅱ处理hiPSC‑CM一定时间后，可以有效诱导hiPSC‑CM凋亡。本发明专利技术一些实例，使用血管紧张素Ⅱ诱导人心肌细胞的凋亡，构建与人体更加接近的心肌细胞凋亡模型，为后续的药理实验提供有力的工具和方法。

【技术实现步骤摘要】
一种构建人心肌细胞凋亡模型的方法
本专利技术涉及一种细胞模型的构建方法，特别涉及一种构建人心肌细胞凋亡模型的方法。
技术介绍
心力衰竭是在老年人中非常流行的慢性病，且它的患病率和发病率正逐年上涨。全球接近2600万人次正在遭受心力衰竭的痛苦，5年内的存活率少于53％。每年全球因慢性心力衰竭治疗而造成的经济负担超过1080亿美元。心力衰竭是很多心血管疾病的末期表现，例如，缺血性心脏病，风湿性心脏病。由于个体差异，使得心力衰竭的治疗难以达到满意的效果。十分迫切建立评估不同药物对每个心力衰竭病人的效果的方法。随着iPS(诱导多能干细胞)技术的发展、心肌细胞分化及纯化方法的建立，使得我们可以在体外制备来自患者的心肌细胞。这些心肌细胞已经协助我们研究心血管疾病，(如：长QT间期综合征，心律不齐，肥厚型心肌病，扩张型心肌病，线粒体心肌病，等)以及进行治疗心血管疾病药物的药理实验和心脏毒性试验(如：醛固酮拮抗剂，血管紧张素转化酶抑制剂，血管紧张素II受体阻断剂，β受体阻滞剂，血管紧张素脑啡肽酶受体抑制剂，等)。建立人心肌细胞凋亡模型的方法对后续的研究十分重要，现有技术一般使用双氧水(过氧化氢)诱导细胞的凋亡。而过氧化氢并不是正常情况下导致人心力衰竭的原因,应用范围及其有限。作为RAS系统(肾素-血管紧张素系统，能调节心血管疾病的病理过程，例如心力衰竭和高血压)的主要效应因子，血管紧张素II(AngiotensinII)通过激活血管紧张素II受体引起细胞凋亡，细胞肥大和心肌重构。因此，由血管紧张素II诱导的心肌细胞凋亡更加贴合和反映真实情况下的心力衰竭，在心力衰竭的病例机制中扮演着决定性角色。有研究显示，血管紧张素II可诱导hiPSC(人诱导多能干细胞)和hESC(人胚胎干细胞)来源的心肌细胞肥大，也有报道显示血管紧张素II的处理组和未处理组的细胞死亡和存活率无显著性差异。然而，没有研究表明血管紧张素II可以引起hiPSC-CM(人诱导多能干细胞分化的心肌细胞)凋亡。血管紧张素II受体有两种类型：AT1和AT2。一般认为，AT1参与血管紧张素II的主要作用，如增殖、肥大和纤维化，而血管紧张素II通过与AT2结合而引起细胞凋亡和心脏重构。对hiPSC-CM的基因表达分析，显示hiPSC-CM的AT2表达缺失，这可能是导致以前报道的血管紧张素II未能引起hiPSC-CM细胞凋亡的原因。构建一种能更为有效反应真实心血管的hiPSC-CM细胞凋亡模型，具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种构建可以更为有效反应真实心血管的hiPSC-CM细胞凋亡模型的方法。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供：血管紧张素Ⅱ在制备hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡诱导剂中的应用。在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为100μM～1mM。在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为150μM～1mM。在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的诱导时间不少于6天。在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的诱导时间为6～10天。血管紧张素Ⅱ的使用终浓度大于100μM时，诱导培养超过6天即可有效诱导hiPSC-CM凋亡。本专利技术的第二个方面，提供：血管紧张素Ⅱ在构建hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡模型中的应用。在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为100μM～1mM。在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为150μM～1mM。在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的诱导时间不少于6天。在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的诱导时间为6～10天。本专利技术的第三个方面，提供：一种构建hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡模型的方法，包括在hiPSC分化而来的心肌细胞的培养液中添加终浓度为100μM～1mM的血管紧张素Ⅱ，继续培养得到获得凋亡的hiPSC-CM。在一些实例中，所述培养液中hiPSC-CM的浓度为(2～10)×104/mL。在一些实例中，所述继续培养的时间不少于6天。在一些实例中，所述继续培养的时间为6～10天。在一些实例中，所述培养液中血管紧张素Ⅱ的终浓度为150μM～1mM。实验结果表明，更高浓度(1mM)的血管紧张素Ⅱ诱导，细胞凋亡的比例更高。可以根据需要调节血管紧张素Ⅱ的使用浓度。本专利技术的有益效果是：专利技术人在研究过程中意外发现，一定浓度之上的血管紧张素Ⅱ处理hiPSC-CM一定时间后，可以有效诱导hiPSC-CM凋亡。本专利技术一些实例，使用血管紧张素Ⅱ诱导人心肌细胞的凋亡，构建与人体更加接近的心肌细胞凋亡模型，为后续的药理实验提供有力的工具和方法。附图说明图1是不同浓度AngⅡ短期处理对hiPSC-CM活力的影响；图2是不同浓度AngⅡ长期处理对hiPSC-CM活力的影响；图3是不同浓度AngⅡ处理2天对hiPSC-CM各基因表达的影响；图4是不同浓度AngⅡ处理10天对hiPSC-CM各基因表达的影响；图5是不同浓度AngⅡ处理10天的流式细胞分析结果。具体实施方式下面结合实验，进一步说明本专利技术的技术方案。1、按常规的，公认的方法获得iPS细胞。2、按常规的，公认的方法将iPS细胞分化成心肌细胞并进行纯化。或具体的，可参照如下方法获得纯化的hiPSC-CM。hiPSC-CM的获得1.1hiPSC细胞的培养：将人诱导多能干细胞DYR0100(ATCC)接种于Matrigel基质(康宁，354277)包被的平板上，然后用Stemflex培养基(Gibco，A3349401)进行培养。StemFlex培养基每两天更换一次。iPSC每隔3天传代一次，或在细胞培养达到80-90％汇合度时传代。传代过程中用1×DPBS(Gibco，14040133)冲洗1次，然后在室温下用使用1×DPBS(Gibco，14190144)稀释的0.5mMEDTA(Invitgen，15575020)在中处理10min。传代比为1：3-1：6。1.2hiPSC细胞的分化：在RPMI-BSA培养基[RPMI1640培养基(HyClone，SH30027.01)+213μg/mLAA2P(l-抗坏血酸2-磷酸镁)(A8960，Sigma)和0.1％牛血清白蛋白(A1470，Sigma)]中，加入CHIR99021(Tcriis4423，终浓度为10mmolM)处理iPSC24小时，然后换RPMI-BSA培养基静止培养。在分化第4天，在RPMI-BSA培养基中加入IWP2(Tcriis3533，终浓度5μM)处理细胞。48h后换用RPMI-BSA培养基。在随后的实验中，用RPMI1640培养基加3％的血清替代物(Gibco，10828-028)培养心肌细胞。1.3hiPSC-CM细胞的纯化：使用代谢选择方法纯化hiPSC-CM。代谢选择培养基为添加0.1％牛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.血管紧张素Ⅱ在制备hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡诱导剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.血管紧张素Ⅱ在制备hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡诱导剂中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为100μM～1mM。


3.血管紧张素Ⅱ在构建hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡模型中的应用。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为100μM～1mM。


5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于：血管紧张素Ⅱ持续处理hiPSC分化而来的心肌细胞的时间不少于6天。


6.一种构建hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡...

【专利技术属性】
技术研发人员：林彬，高强，庄建，岑坚正，麦锦连，周丽诗，
申请(专利权)人：广东源心再生医学有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44