一种高效分离人滑膜原代细胞的方法技术

本发明专利技术属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种高效分离人滑膜原代细胞的方法。本发明专利技术所述高效分离人滑膜原代细胞的方法，采用Hank′s平衡盐溶液对滑膜进行预处理，并在加入Ⅱ型胶原酶和糖苷酶消化处理后于CO

【技术实现步骤摘要】
一种高效分离人滑膜原代细胞的方法
本专利技术属于生物技术及细胞培养
，具体涉及一种高效分离人滑膜原代细胞的方法。
技术介绍
滑膜(synovium)是关节囊的内层，呈淡红色，薄而柔软，由疏松结缔组织组成。滑膜可以分泌滑液，在关节活动中起重要作用。正常的滑膜分为两层，即薄的细胞层(内腔层)和血管层(内膜下层)。滑膜细胞起源于骨骼胚基中的间充质。滑膜组织内包含多种细胞，如滑膜细胞、白细胞、脂肪细胞等。滑膜细胞又分A型和B型两种。巨噬细胞样A型细胞(MLC)有丝状伪足，具有吞噬功能，不具有增殖能力。B型滑膜细胞(FLC)又称成纤维滑膜细胞，分裂增殖迅速，可以进行体外传代培养。由于滑膜细胞可以分泌多种炎症介质，如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1(IL-1)等介质参与关节损伤的病理过程。滑膜细胞是维持关节正常功能的重要组织结构，同时也是各种关节疾病疾患时的主要病变部位，特别是内风湿性关节炎中滑膜组织的改变最为明显。通过体外培养滑膜细胞，并检测其功能，在研究骨关节炎发病机制、临床疗效作用机制、抗风湿等新型药物筛选及药理机制方面具有重要意义，而体外培养滑膜细胞也是研究其形态、结构和功能，及其在关节病中的作用和影响的前提和基础。而如何最大限度的将滑膜原代细胞从滑膜组织中进行分离，同时保持细胞的完整性和代谢活性，是亟需解决的一个难题。目前，滑膜细胞培养法有组织块培养法、酶消化法等。组织块培养法是在无菌的条件下取出滑膜组织，用无菌的PBS溶液冲洗3遍，然后用眼科剪分离滑膜周围的脂肪组织并将滑膜剪碎成1-2mm3的碎块，将碎块在细胞培养瓶底部均匀铺展，加入2mlDMEM完全培养液，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每3-5d更换培养基并小心除去非贴壁组织块，当成纤维样滑膜细胞铺满70％-80％的瓶底时传代。酶消化法是在超净台内取出滑膜组织，用无菌PBS溶液冲洗3遍，分离滑膜组织，然后将滑膜组织充分剪碎后放入培养瓶中，用0.25％胰蛋白酶消化30min，离心弃胰酶，再加入胶原酶消化2h，最后过滤加入2mlDMEM完全培养液，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每24h换液1次，细胞长满瓶底时进行传代。在临床应用中，组织块培养法的缺点是组织块种植困难不易成活、且原代细胞生长周期长、细胞数量少；酶消化法的缺点是不能有效消化分离纤维组织，使滑膜细胞不易游离，且过筛网时堵塞网孔，故细胞数量很少。可见，开发一种可获得纯度高数量足的滑膜细胞的高效分离滑膜细胞的方法具有积极的意义。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种高效、稳定、便捷分离人滑膜原代细胞的培养方法，该方法可简化传统原代培养方法，降低成本，得到大量的滑膜细胞。为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种高效分离人滑膜原代细胞的方法，包括如下步骤：(1)取人体新鲜滑膜组织置于无菌培养皿中，采用Hank′s平衡盐混合液反复冲洗，并将清洗后的滑膜组织转移至无菌培养瓶中，以无菌剪刀剪碎，移入EP管并加入Hank′s平衡盐混合液混匀，离心并弃上清；(2)收集离心后的沉淀物，加入含有青链霉素混合液的DMEM培养液重悬，并加入含Ⅱ型胶原酶和糖苷酶的消化液，置于CO2培养箱中进行消化培养；(3)培养结束后，取出培养物并加入胰蛋白酶，吹打成浆状，随后用无菌细胞过滤筛过滤，收集滤液并离心，弃上清；(4)收集离心后的沉淀物，用DMEM高糖培养液重悬沉淀物，置于细胞培养瓶于CO2细胞培养箱中，进行细胞培养，待细胞贴壁，即得所需人滑膜原代细胞。具体的，所述步骤(1)中，所述Hank′s平衡盐包括如下成分：具体的，所述步骤(1)中，所述剪碎步骤为将所述滑膜组织剪碎至呈泥状、无颗粒感，且体积不大于1mm3。具体的，所述步骤(2)中，所述青链霉素在所述DMEM培养液中的质量浓度为0.5-1.5wt％。具体的，所述步骤(2)中，所述消化液中，所述Ⅱ型胶原酶的含量为0.1-1U/mL。具体的，所述步骤(2)中，所述消化液中，所述糖苷酶的含量为0.1-1U/mL。具体的，所述步骤(2)中，所述消化培养步骤为35-40℃、3-8％CO2培养箱消化培养6h。具体的，所述步骤(3)中，控制所述胰蛋白酶的含量为0.2U/每mL培养物。具体的，所述步骤(4)中，所述DMEM高糖培养液中还包括0.5-1.5wt％青链霉素和8-12wt％澳洲胎牛血清。具体的，所述步骤(4)中，所述细胞培养步骤为置于35-40℃、3-8％CO2恒温培养。具体的，所述步骤(4)中，还包括在培养48h后进行更换培养液的步骤。本专利技术所述高效分离人滑膜原代细胞的方法，采用Hank′s平衡盐溶液对滑膜进行预处理，并在加入Ⅱ型胶原酶和糖苷酶消化处理后于CO2培养箱中进行消化培养，随后再次加入胰蛋白酶(无需加入酚红、EDTA)进行处理；经两次酶消化后的细胞经DMEM高糖培养液重悬后再次进行CO2培养，可高效分离人滑膜组织中的滑膜细胞，并大大缩短组织块贴壁时间，获得纯度高、数量足的滑膜细胞，且获得的滑膜细胞活性强，形态完整，更接近体内滑膜细胞的生物学特性。本专利技术所述分离方法，通过提高人滑膜细胞原代培养的得率，显著提高临床人体滑膜标本的使用效率，并能够后续稳定培养，为骨关节的研究奠定实验基础，提高科研效率。本专利技术所述高效分离人滑膜原代细胞的方法，由于滑膜细胞可分泌透明质酸、粘蛋白等，且滑膜组织具有一定的粘弹性，选用含Ⅱ型胶原酶和糖苷酶的消化液进行处理，可水解糖苷键，降低滑膜组织的粘弹性，促进组织消化，进一步提高消化处理的效果，提高细胞分离的数量和质量。本专利技术所述高效分离人滑膜原代细胞的方法，简化传统原代培养方法，操作简单，污染率低，成功率高，有助于降低成本，可得到大量的滑膜细胞，是一种高效、稳定、便捷的分离人滑膜原代细胞的培养方法，具有较好的工业应用前景。附图说明为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面根据本专利技术的具体实施例并结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明，其中，图1为实施例1中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；图2为实施例2中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；图3为实施例3中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；图4为对比例1中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；图5为所述组织剪碎器皿的结构示意图；图6为所述组织剪碎器皿的优选结构示意图；图7为所述组织剪碎器皿适配支物架的结构示意图。具体实施方式本专利技术下述实施例中：所述Hank′s平衡盐混合液包括如下成分：称量上述药品后，准备1000ml的烧杯，加入1000ml超纯水溶解上述药品，以磁力搅拌器助溶，使用前用蒸馏水和超纯水分别洗一次磁珠；上述药品充分溶解后，用50ml的离心管分装，在超净台内用滤膜进行过滤，以封口膜进行保存。所述DMEM培养液成分包括(mg/L)：无水氯化钙200、硝酸铁.9H本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效分离人滑膜原代细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)取人体新鲜滑膜组织置于无菌培养皿中，采用Hank′s平衡盐混合液反复冲洗，并将清洗后的滑膜组织转移至无菌培养瓶中，以无菌剪刀剪碎，移入EP管并加入Hank′s平衡盐混合液混匀，离心并弃上清；/n(2)收集离心后的沉淀物，加入含有青链霉素混合液的DMEM培养液重悬，并加入含Ⅱ型胶原酶和糖苷酶的消化液，置于CO

【技术特征摘要】
1.一种高效分离人滑膜原代细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取人体新鲜滑膜组织置于无菌培养皿中，采用Hank′s平衡盐混合液反复冲洗，并将清洗后的滑膜组织转移至无菌培养瓶中，以无菌剪刀剪碎，移入EP管并加入Hank′s平衡盐混合液混匀，离心并弃上清；
(2)收集离心后的沉淀物，加入含有青链霉素混合液的DMEM培养液重悬，并加入含Ⅱ型胶原酶和糖苷酶的消化液，置于CO2培养箱中进行消化培养；
(3)培养结束后，取出培养物并加入胰蛋白酶，吹打成浆状，随后用无菌细胞过滤筛过滤，收集滤液并离心，弃上清；
(4)收集离心后的沉淀物，用DMEM高糖培养液重悬沉淀物，置于细胞培养瓶于CO2细胞培养箱中，进行细胞培养，待细胞贴壁，即得所需人滑膜原代细胞。


2.根据权利要求1所述的高效分离人滑膜原代细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述Hank′s平衡盐包括如下成分：





3.根据权利要求1或2所述的高效分离人滑膜原代细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述青链霉素在所述DMEM培养液中的质量浓度为0.5-1.5wt％。


4.根据权利要求1-3任一项所述的高效分离人滑膜原代细胞的方法，其特征在于，所述步...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹丹，曹盛楠，师浩钧，刘凡杰，孙国栋，王平，王磊磊，李华忠，陈元振，侯广建，王涛，孟岩，任鹏程，
申请(专利权)人：山东省医药生物技术研究中心山东省病毒研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37