DUSP13在治疗心肌细胞凋亡相关的心血管疾病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种DUSP13在治疗心肌细胞凋亡相关的心血管疾病中的应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术发现MYOG基因通过调控DUSP13对ROS作用下心肌细胞提供抗凋亡保护的方法；本发明专利技术通过过氧化氢(H2O2)模拟氧化应激环境观察过表达MYOG的人心肌细胞的凋亡情况，首次发现MYOG基因通过直接上调DUSP13表达来抑制ROS诱导的心肌细胞凋亡，为进一步研究MYOG和DUSP13作为疾病的治疗和药物开发靶向位点奠定基础。定基础。定基础。

【技术实现步骤摘要】
DUSP13在治疗心肌细胞凋亡相关的心血管疾病中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及DUSP13在治疗心肌细胞凋亡相关的心血管疾病中的应用。

技术介绍

[0002]心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是目前人类健康的头号杀手，全球每年死于心血管疾病的人数多于其它任何原因。据世界卫生组织(WHO)统计，全球死亡人数中1/3死于心血管疾病，其中中国是心血管疾病死亡人数最多的国家。随着人民生活水平的提高和饮食结构的变化，心血管疾病的患病率和死亡率仍呈明显上升趋势。
[0003]心肌细胞凋亡参与多种心血管疾病病理生理过程，包括原发性高血压、缺血性心脏病和再灌注损伤、心肌炎、心肌病、心律失常、心脏衰竭、先天性心脏病等。心肌细胞凋亡机能异常是发生多种重症心血管病的重要机制。通过干预细胞凋亡程序的进行，抑制心肌细胞凋亡的发生，挽救心脏和心功能，已成为心血管疾病药物研究的重要方向之一。目前临床上抑制心肌细胞凋亡的药物有他汀类、β
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受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂等，但存在不同程度的副作用。
[0004]氧化应激(oxidative stress，OS)指机体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生过多，导致氧化和抗氧化系统失衡，引起细胞或组织氧化损伤的一种病理状态。在心血管疾病的发生发展中氧化应激扮演着重要角色，活性氧(ROS)产生的增加依次导致多种心脏致病效应，包括凋亡、自噬、衰老、肥厚、纤维化和心肌重塑,寻找有效的抗氧化措施，可为心血管疾病提供更有针对性的防治方案。目前研究氧化应激应用最广泛的体外模型是过氧化氢H2O2氧化损伤模型。
[0005]转录因子MYOG编码肌细胞生成素(Myogenin)蛋白，是生肌调节因子(MRFs)基因家族的成员之一。MRFs转录因子家族(包括Myod、Myf5、Mrf4和MYOG)在骨骼肌发生的各个阶段都起着关键作用。该家族所有成员共同含有一个保守的螺旋
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环
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螺旋(bHLH)基序，可以与下游基因的E盒结合，从而激活下游肌肉特异性基因的表达。研究表明，MYOG通过控制、启动成肌细胞的融合和肌纤维的形成，而在肌肉分化过程中起关键作用。在小鼠中的研究显示，MYOG基因缺失会导致严重的肌肉分化缺陷，从而造成围产期死亡。因此，MYOG是骨骼肌发育过程中必需的调控因子，并且是不可替代的。目前，已有研究证实，MYOG基因能抑制由血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡，但对其抑制心肌细胞凋亡的具体机制仍不清楚，并对由活性氧诱导的心肌细胞凋亡是否具有抑制作用及作用机制尚未见报道。
[0006]DUSPs(双特异性磷酸酶)是一类异质蛋白磷酸酶，可催化磷酸化酪氨酸和磷酸化丝氨酸/苏氨酸残基上的蛋白质去磷酸化。DUSPs被认为在细胞信号转导、细胞生长、分化、转录和凋亡中起着重要的调节作用。目前已发现61种形态和结构不同的双特异性磷酸酶，可根据特定结构域的存在和序列相似性分为七类：slingshots，PRLs(phosphatases of regenerating liver)，Cdc14 phosphatases(Cdc is cell division cycle)，PTENs(phosphatase and tensin homologues deleted on chromosome 10)，myotubularins，
MKPs(mitogen activated protein kinase phosphatases)and atypical DUSPs。
[0007]DUSP13是一种atypical DUSPs(非典型双特异性磷酸酶)，其通过开放阅读框编码产生两个不同却密切相关的非典型DUSPs，DUSP13B(TMDP)和DUSP13A(MDSP)。有研究表明DUSP13B参与精子形成过程中睾丸生殖细胞的减数分裂和分化的调控，在保护精子免受外部压力方面发挥着重要作用，还具有脱磷并使应激激活的MAP激酶JNK和p38失活的作用。DUSP13A是一种肌肉限制性双特异性磷酸酶，仅在骨骼肌中表达，并能激活凋亡信号调节激酶(ASK1)活性。

技术实现思路

[0008]本专利技术发现MYOG基因通过调控DUSP13对ROS作用下心肌细胞提供抗凋亡保护的方法；本专利技术通过过氧化氢(H2O2)模拟氧化应激环境观察过表达MYOG的人心肌细胞的凋亡情况，首次发现MYOG基因通过直接上调DUSP13表达来抑制ROS诱导的心肌细胞凋亡，为进一步研究MYOG和DUSP13作为疾病的治疗和药物开发靶向位点奠定基础。
附图说明
[0009]图1为本专利技术的技术流程图；
[0010]图2为实施例2中MYOG表达水平测定图；
[0011]图3为实施例2中MYOG免疫荧光染色图；
[0012]图4为实施例3中Annexin V法检测处理后的心肌细胞凋亡情况的结果图；
[0013]图5为实施例4中RNA测序与分析MYOG调控DUSP13表达的结果图；
[0014]图6为双荧光素酶实验的统计结果图；
[0015]图7为流式检测DUSP13表达对H2O2处理的心肌细胞凋亡情况的统计结果图。
具体实施方式
[0016]为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
[0017]如图1所示，本专利技术的技术流程如下：
[0018]1、构建pCW
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EGFP
‑
MYOG载体。
[0019]2、包装慢病毒。
[0020]3、转染人心肌细胞。
[0021]4、用盐酸多西环素(Dox)诱导hCM
‑
MYOG细胞表达MYOG基因，Dox浓度为2μg/mL。
[0022]5、用过氧化氢诱导hCM、hCM
‑
MYOG凋亡，过氧化氢浓度为1mM。
[0023]7、测定细胞凋亡，RNA
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seq与分析，检测蛋白水平。
[0024]8、检测启动子区域，检测细胞凋亡。
[0025]实施例1：获得hCM
‑
MYOG细胞株
[0026]1.1慢病毒表达载体构建：用常规分子克隆方法将MYOG cDNA和EGFP绿色荧光蛋白基因亚克隆到pCW
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Cas9
‑
Blast载体中(Addgene，83481)，得到pCW
‑
EGFP
‑
MYOG。
[0027]1.2慢病毒包装
[0028]1.2.1接种HEK293T细胞到6孔板中，用D10培养液(DMEM培养液+10％胎牛血清+1％
PS)进行培养，待细胞汇合度达到70％
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80％时准备进行转染。
[0029]1.2.2在转染前1h，弃去原来培养液，加入2m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.DUSP13在制备治疗心肌细胞凋亡相关的心血管疾病的药物中的应用。2.DUSP13在制备抑制心肌细胞凋亡的药物中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，心肌细胞凋亡为氧化应激诱导的心肌细胞凋亡。4.上调DUSP13基因表达的试剂在制备治疗心肌细胞凋亡相关的心血管疾病的药物中的应用。5.上调DUSP13基因表达的试剂在制备抑制心肌细胞凋亡的药物中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，心肌细胞凋亡为氧化应激诱导的心...

【专利技术属性】
技术研发人员：林彬，周丽诗，高强，罗静，岑坚正，
申请(专利权)人：广东源心再生医学有限公司，
类型：发明
国别省市：