基于CRISPR检测小血管闭塞相关基因PTGS2位点突变的试剂盒制造技术

本发明专利技术属于基因突变检测技术领域，公开了基于CRISPR检测小血管闭塞基因PTGS2突变的试剂盒，所述试剂盒包括针对PTGS2基因rs689466和rs5275位点设计的突变型crDNA或突变型crRNA，其序列如SEQ IDNO.1～4所示，结合CRISPR

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR检测小血管闭塞相关基因PTGS2位点突变的试剂盒


[0001]本专利技术属于基因突变检测
，具体涉及一种基于CRISPR检测小血管闭塞相关基因PTGS2位点突变的试剂盒。

技术介绍

[0002]世界范围内，脑卒中(stroke)是第二大死因，在所有脑卒中(stroke)患者中约87％是缺血性卒中。而在我国，急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)约占70％。研究表明，约30％的缺血性脑血管病是小血管闭塞(smallarteryocclusion，SAO)所致，这类卒中的治疗和预防目前尚未取得显著进展。但大量病因学研究已经表明，IS的发生是一个多步骤、过阶段的复杂过程，是环境因素和遗传因素共同作用的结果。
[0003]根据当前国际普遍使用TOAST分型，IS分为大动脉粥样硬化(LAA)型、心源性脑栓塞(CE)型、小动脉闭塞(SAO)型、其他明确原因型和不明原因型。SAO约占所有IS的四分之一，其发病机制尚未明确。中风的原因有很多，如高血压、糖尿病、血脂异常、吸烟和遗传背景。特别是遗传背景占IS的30
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40％。炎症对血栓形成的整个过程都有影响。首先，炎症不仅可能促进血栓形成，还可能抑制内源性纤维蛋白溶解以增强血栓稳定性其次，炎症介质吸附免疫细胞并溶入脑实质，进一步破坏血脑屏障，促进血栓形成。多种炎症相关介质参与这一过程。前列素内环氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase2 PTGS2)，又称COX2，是血管内皮细胞、平滑肌细胞和血小板中重要的诱导酶。它是由细胞因子和生长因子诱导的，与动脉粥样硬化的形成密切相关多项研究报道了PTGS2基因多态性与IS风险之间的关联，并且进一步研究表明PTGS2 rs689466T>C和rs5275 A>G，增加小动脉闭塞风险。
[0004]现阶段临床一般通过定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction，Q
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PCR)、非放射性原位杂交技术(fluorescence in situhybridization，Fish)、多重引物PCR(multiplex PCR)等方式对患者进行基因突变检测，然而这些检测技术均存在检测时间长过程复杂或检测成本过高等问题，导致无法应用到大规模的临床样本研究中。因此亟需提供一种温度控制简单，且灵敏度、特异性高的特异性片段检测方法。
[0005]RNA引导的成簇规则间隔短回文重复序列
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CRISPR(CRISPR
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Cas)相关方法由于其高可靠性和特异性而在快速核酸检测方面显示出相当大的前景。目前已经开发了几种类型的Cas核酸酶用于CRISPR
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Cas系统，例如Cas9、Cas12等。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于解决现有技术中检测时间长、成本过高和准确性不高以致无法大规模检测临床样本基因突变的问题，提供了一种基于CRISPR技术检测与小血管闭塞相关的PTGS2基因是否存在rs689466和/或rs5275目标突变位点和检测该靶核酸在目标区域是否存在突变的试剂盒。
[0007]为达到上述技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0008]本专利技术首先提供一种检测小血管闭塞相关基因PTGS2位点突变的突变型crDNA或突变型crRNA，
[0009]所述突变型crDNA为如下任一：
[0010]A1).rs689466突变型crDNA，其序列如SEQ ID NO.1所示；
[0011]A2).rs5275突变型crDNA，其序列如SEQ ID NO.2所示；
[0012]A3).A1)和A2)；
[0013]所述突变型crRNA为如下任一：
[0014]B1).rs689466突变型crRNA，其序列如SEQ ID NO.3所示；
[0015]B2).rs5275突变型crRNA，其序列如SEQ ID NO.4所示；
[0016]B3).B1)和B2)。
[0017]本专利技术其二提供一种基于CRISPR检测小血管闭塞相关基因PTGS2位点突变的试剂盒，包括上述突变型crDNA或突变型crRNA。
[0018]优选的，所述试剂盒包括以下任一：
[0019]C1).用于特异性扩增PTGS2基因上rs689466多态性位点的引物对，具体为：
[0020]rs689466
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F，其序列如SEQ ID NO.5所示；
[0021]rs689466
‑
R，其序列如SEQ ID NO.6所示；
[0022]C2).用于特异性扩增PTGS2基因上rs5275多态性位点的引物对，具体为：
[0023]rs5275
‑
F，其序列如SEQ ID NO.7所示；
[0024]rs5275
‑
R，其序列如SEQ ID NO.8所示；
[0025]C3).C1)和C2)。
[0026]可以理解的是，引物对的选择依据试剂盒中突变型crDNA或突变型crRNA的序列而定。
[0027]优选地，所述试剂盒包括荧光探针和cas12a蛋白；更加优选地，所述cas12a蛋白为Fncas12a蛋白。
[0028]优选地，所述试剂盒包括荧光探针，所述荧光探针的5
’
端标记有荧光报告基团，所述荧光探针的3
’
端标记有荧光猝灭基团；更加优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE、Texas Red中的任意一种，所述荧光猝灭基团选自TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ1、BHQ2、BHQ3中的任意一种。
[0029]优选地，所述试剂盒包括DNA酶抑制剂和无酶水。
[0030]本专利技术还提供上述任一种试剂盒在检测与小血管闭塞相关的PTGS2基因突变中的应用。
[0031]优选的，所述应用的过程具体为：对待测DNA样品进行PCR扩增，扩增完成后加入检测混合液反应，并采集荧光变化；所述检测混合液含有荧光探针和所述突变型crRNA；所述突变型crDNA在T7 RNA聚合酶作用下生成RNA，经回收纯化得到对应的crRNA。
[0032]更优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃3min进行预变性；95℃10s，55
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60℃20s，循环25
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30次；最后降温至25℃，反应结束。
[0033]更优选的，所述检测混合液共50ul，具体为：250～500nM纯化的cas12a蛋白，250～500nM突变型crRNA，1～5μL荧光探针，2μL DNA酶抑制剂，无酶水余量。
[0034]与现有技术相比，本专利技术的有益本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测小血管闭塞相关基因PTGS2位点突变的突变型crDNA或突变型crRNA，其特征在于，所述突变型crDNA包括：rs689466突变型crDNA，其序列如SEQ ID NO.1所示；和/或rs5275突变型crDNA，其序列如SEQ ID NO.2所示；所述突变型crRNA包括：rs689466突变型crRNA，其序列如SEQ ID NO.3所示；和/或rs5275突变型crRNA，其序列如SEQ ID NO.4所示。2.一种基于CRISPR检测小血管闭塞相关基因PTGS2位点突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述突变型crDNA或突变型crRNA。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性扩增PTGS2基因上rs689466位点的引物对：其序列如SEQ ID NO.5
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6所示；和/或用于特异性扩增PTGS2基因上rs5275位点的引物对：其序列如SEQ ID NO.7
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8所示。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas12a蛋白和荧光探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖以磊，郝瑜，周杰，王凯颖，刘青，孙晓雨，樊亚明，程诚，姚杰，张倩玉，吴成高，
申请(专利权)人：江苏博嘉生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：