一类重复小单元序列抗菌肽类似物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一类重复小单元序列抗菌肽类似物，其是以色氨酸和精氨酸为基本氨基酸组成，并以WRX为骨架序列进行重复性排列，然后进行C末端酰胺化得到，标记为(WRX)

【技术实现步骤摘要】
一类重复小单元序列抗菌肽类似物及其应用
本专利技术属于生物化学
，涉及一类重复小单元序列抗菌肽类似物，本专利技术同时还涉及该类抗菌肽类似物在制备高效低毒抗菌药物中的应用。
技术介绍
“ESKAPE”病原体通常与抗菌素耐药性息息相关(Nature2019,1-6)。“ESKAPE”的耐药性，主要与其细菌细胞膜渗透性有关：绝大多数抗生素均在细菌胞内发生分子内作用而导致细菌死亡，当连续使用大量的抗生素后，细菌细胞膜通透性发生改变，抗生素不能有效透过细菌细胞膜，限制了细菌内部抗生素的积累，从而导致耐药性的发生(LancetInfect.Dis.2006,6,589-601)。阳离子抗菌肽(CAMPs)由于其独特、理想的膜渗透活性，成为开发理想抗菌药物的最佳候选(Nature2002,415,389)。目前，已在抗菌肽数据库中发现了超过3000个AMPs。虽然AMPs作为抗菌剂被广泛研究和测试，但其复杂的合成路线、缺乏选择性等阻碍了其在临床的应用。短肽基序在识别、结合、信号转导、催化、细胞粘附、运动、生长甚至凋亡、机体防御和保护等许多生物学功能中发挥着重要作用(Langmuir.2020Feb2)。典型的两亲性α-螺旋肽或其他抗菌肽通常需要形成一定的构象，才能实现有效的膜渗透作用。而短肽序列本身往往具有无序的结构，这种无序性恰好可以使其结构更灵活，更容易与细菌细胞膜作用(Angew.Chem.,Int.Ed.49(2010)8462-8465)。如HaoningGong等人报道了含重复单元序列的抗菌肽G3：G(IIKK)3I-NH2具有较为理想的抗菌活性(ACSApplMaterInterfaces.2019Sep25；11(38):34609-34620)；紧接着，KangLiu等人设计了脂肪酸修饰的重复单元序列抗菌肽C16-G3(IIKK)3I-NH2，也表现出较好的抗菌活性(Langmuir.2020Feb2)。而申请号为201810286215.2的专利技术专利(一种富含色氨酸抗菌肽WK12及其制备方法和应用)公布的一种序列为WRLRWKTRWRLK-NH2的重复单元序列抗菌肽，其以(WXYX)3为序列模板，抗菌活性强，细胞选择性较高，但该抗菌肽是从已有猪源性抗菌肽PMAP-36的特征性片段中截取和改造而得到的，且含有W、R、L、K、T等多种氨基酸，存在因设计复杂而造成制造成本高的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一类设计简单、制造成本低、具有较强的抗菌活性和较高细胞选择性的重复小单元序列抗菌肽类似物。本专利技术的另一目的是提供上述重复小单元序列抗菌肽类似物在制备高效低毒抗菌药物中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一、重复小单元序列抗菌肽类似物的结构设计本专利技术涉及的重复小单元序列抗菌肽类似物，是以色氨酸和精氨酸为基本氨基酸组成，并以WRX为骨架序列进行重复性排列，然后进行C末端酰胺化得到，标记为(WRX)n，其中n＝2，3，4，5；X＝I、L、F、W、K。具体地，本专利技术涉及的重复小单元序列抗菌肽类似物其结构式如下：标记为(WRI)n，n＝2，3，4，5；标记为(WRL)n，n＝2，3，4，5；标记为(WRF)n，n＝2，3，4，5；标记为(WRW)n，n＝2，3，4，5；标记为(WRK)n，n＝2，3，4，5。作为本专利技术技术方案的进一步优选，所述抗菌肽类似物包括(WRI)3，(WRL)3，(WRF)3，(WRW)2，(WRW)5，(WRK)4和(WRK)5，其氨基酸序列分别如SEQIDNo.1至SEQIDNo.7所示。上述重复小单元序列抗菌肽类似物均采用经典固相合成法制备得到。二、重复小单元序列抗菌肽类似物在制备高效低毒抗菌药物中的应用1、体外抗菌实验采用二倍稀释法测定上述重复小单元序列抗菌肽类似物对细菌菌株的最低抑菌浓度(MIC)，评估其抗菌活性。所选用的细菌菌株包括：革兰氏阴性菌(E.coliATCC25922，P.aeruginosATCC27853，A.baumanniiATCC19606)，革兰氏阳性菌(S.aureusATCC25923，S.epidermidisATCC12228,B.subtilisATCC23857)。实验方法为：将生长至对数中期的细菌在MH培养基中稀释成浓度为1×106CFU/mL的细菌悬浮液；将抗菌肽类似物溶解于无菌水，并用二倍稀释法配制成一系列不同浓度的抗菌肽溶液，再与等体积细菌悬浮液混合，于96孔培养板中37℃孵育18-24h观察，无肉眼可见细菌生长的最小浓度即为对应最低抑菌浓度(MIC)。上述实验以抗生素Gentamicin作阳性对照，平行重复三次，结果如表1所示。表1本专利技术重复小单元序列抗菌肽类似物对抗标准菌株的最低抑菌浓度表1结果表明，本专利技术重复小单元序列抗菌肽类似物对常见菌株均具有较强的抗菌活性，抗菌肽类似物(WRK)4、(WRK)5对革兰氏阴性菌A.baumanniiATCC19606的抗菌活性与抗生素Gentamicin相当。2、溶血实验取新鲜小鼠血液，经1000g离心10min弃去上层血清，下层血细胞用PBS(10mM，pH7.4)清洗后，配制成含有8％血细胞的悬浮液，加于96孔板中；将抗菌肽类似物溶解于PBS中，用二倍稀释法配制成不同浓度的肽溶液，将其等体积与上述血细胞悬浮液加于96孔板中，37℃孵育1h；共孵物1200g离心15min后，酶标仪检测上清液在490nm处的吸光值；PBS空白溶液作阴性对照，1％TritonX-100作阳性对照，根据公式：Hemolysisrate(％)＝[(OD490nmpeptides-OD490nmnegativecontrol)/(OD490nmpositivecontrol-OD490nmnegativecontrol)]×100％，计算溶血率，并结合MIC，计算治疗指数，结果如表2。表2本专利技术重复小单元序列抗菌肽类似物治疗指数(TI)MHC10：引起10％溶血率的最低检测浓度；GM：MIC的几何平均数；TI：治疗指数，TI＝MHC10/GM；表2结果表明，本专利技术重复小单元序列抗菌肽类似物溶血毒性低，计算其治疗指数发现，该重复小单元序列抗菌肽类似物具有较高的治疗指数，其中(WRK)4和(WRK)5的治疗指数分别高达102.4和128，具有很好的细胞选择性。本专利技术相较于现有技术的有益效果为：1、本专利技术涉及的重复小单元序列抗菌肽类似物，其是以色氨酸和精氨酸为基本氨基酸组成，并以WRX为骨架序列进行重复性排列，然后进行C末端酰胺化得到。该重复小单元序列抗菌肽类似物命名为(WRX)n，其中n＝2，3，4，5；X＝I、L、F、W、K。其骨架序列仅含3个氨基酸，因此设计简单，制造成本低。2、本专利技术涉及的重复小单元序列抗菌肽类似物，具有较强的抗菌活性和较高的细胞选择性；其中，抗菌肽类似物(WRK)4和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一类重复小单元序列抗菌肽类似物，其特征是，所述抗菌肽类似物是以色氨酸和精氨酸为基本氨基酸组成，并以WRX为骨架序列进行重复性排列，然后进行C末端酰胺化得到，标记为(WRX)

【技术特征摘要】
1.一类重复小单元序列抗菌肽类似物，其特征是，所述抗菌肽类似物是以色氨酸和精氨酸为基本氨基酸组成，并以WRX为骨架序列进行重复性排列，然后进行C末端酰胺化得到，标记为(WRX)n，其中n＝2，3，4，5；X＝I、L、F、W、K。


2.如权利要求1所述的一类重复小单元序列抗菌肽类似物...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪京满，王锐，钟超，王一杰，
申请(专利权)人：倪京满，王锐，
类型：发明
国别省市：甘肃;62