一种奥曲肽的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种奥曲肽的制备方法，采用4‑苄氧基苯甲醛树脂为固相载体，直接在固相上将N‑(9‑芴甲氧羰基)‑苏氨醇与树脂上的醛基形成稳定的缩醛，然后通过洗涤即可将副产物分离，极大的简化了工艺，提供了一条全固相奥曲肽制备工艺，解决了目前奥曲肽生产过程中成本高、副反应多以及工艺复杂等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种奥曲肽的制备方法
：本专利技术属多肽化学领域，特别涉及一种奥曲肽的制备方法。
技术介绍
：奥曲肽(式1)为分子内含有一个二硫键的环八肽，是一种人工合成的人生长抑素的八肽衍生物，其作用与天然生长抑素相似。化学名为D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-L-半胱氨酰-L-苏氨醇环-(2→7)-二硫化物；英文名为OctreotideAcetate。瑞士山德士(Sandoz)公司于1982年合成，1988年美国FDA批准醋酸奥曲肽用于胃肠道分泌类肿瘤和垂体肿瘤及肢端肥大症的治疗；1998年美国FDA再次批准醋酸奥曲肽用于肢端肥大症的治疗。公开的奥曲肽制备方法主要有两种：固相方法和液相方法。专利ZL00134258.4采用液相方法合成，步骤繁琐，生产周期长。目前固相方法仍然是制备奥曲肽的主流方法，一类方法，如专利CN201010165270.X，CN200510029221.2及CN201210352668.3采用氯树脂及氯树脂类似物，与苏氨醇连接后合成奥曲肽。这类方法的缺点是氯树脂与苏氨醇的连接效率很低，导致过量苏氨醇及树脂的浪费，同时会增加后续洗涤树脂所需的溶剂消耗量以及最终的成本。另一类固相合成方法采用酯还原的方法得到含有苏氨醇的奥曲肽，如专利ZL21375216，CN201310333598.1，该类方法由于使用到强还原剂硼氢化钠，会导致消旋及其他副反应的发生。还有一类方法是采用添加linker的方案解决苏氨醇与树脂连接效率低的问题，如专利CN201610938844.X，CN200510024502.9及CN2004100108332。该类方法需要先将苏氨醇与linker在通过液相反应合成并纯化后才能用于奥曲肽的制备，增加了工艺周期且额外增加了一个原料的质控，导致工艺复杂化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简便、高效的奥曲肽制备方法，解决目前奥曲肽制备成本高或副反应多或工艺复杂的问题。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一种奥曲肽的制备方法，包括以下步骤：(1)将Fmoc-Thr-Ol及催化剂加入到醛基树脂中进行缩合反应，得到Fmoc-Thr树脂复合物；(2)按照固相多肽合成的方法，根据奥曲肽的序列，将保护氨基酸按C端至N端的顺序逐个偶联到步骤(1)所得树脂上获得保护的奥曲肽-树脂复合物；(3)向保护的奥曲肽-树脂复合物中加入切割试剂，将奥曲肽从树脂上裂解下来，得到还原型奥曲肽粗品，将还原型奥曲肽粗品配制成一定的浓度，加入氧化剂，反应后得到奥曲肽粗品。(4)将奥曲肽粗品分离纯化，得到奥曲肽。本专利技术还提供了一种奥曲肽的制备方法，包括以下步骤：(1)将Fmoc-Thr-Ol及催化剂加入到4-苄氧基苯甲醛树脂中进行缩合反应，得到Fmoc-Thr树脂复合物；(2)向步骤(1)得到的Fmoc-Thr树脂复合物中加入Fmoc脱保护试剂脱除Fmoc保护基，反应结束后过滤并洗涤，得到Thr-树脂，然后向Thr-树脂复合物中加入奥曲肽的C端第二个氨基酸和缩合试剂进行缩合反应，缩合反应结束后洗涤树脂，按照奥曲肽从C端到N端的顺序，更换氨基酸，重复Fmoc脱保护反应和缩合反应，得到保护的奥曲肽-树脂复合物；(3)向保护的奥曲肽-树脂复合物中加入切割试剂，脱除多肽侧链保护基并将奥曲肽从树脂上裂解下来，经沉淀后得到还原型奥曲肽粗品；将还原型奥曲肽粗品配制成一定的浓度，调节pH，加入氧化剂，反应后得到奥曲肽粗品。(4)将奥曲肽粗品经反相高效液相色谱分离纯化，得到奥曲肽。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(1)中的催化剂为对甲苯磺酸；在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(1)中各物质间的比例为n(Fmoc-Thr-Ol)：n(对甲苯磺酸)：n(4-苄氧基苯甲醛树脂)为1～3：0.1～0.5：1。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(1)中的反应时间为8～24小时。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(2)中的Fmoc脱保护试剂是体积比为1：1～4的哌啶与二甲基甲酰胺。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(2)中Fmoc脱保护反应的温度为20～60℃，反应时间为10～60min。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(2)中氨基酸的保护基分别为：所有氨基酸的α氨基均为Fmoc保护基，苏氨酸侧链羟基保护基为叔丁基，半胱氨酸侧链保护基为三苯甲基，赖氨酸和D-色氨酸侧链保护基为叔丁氧羰基。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(2)中缩合试剂为缩合试剂1，缩合试剂2以及缩合试剂3的一种或多种混合；其中，缩合试剂1为N,N-二环己基碳二亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯、卡特缩合剂、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷中的一种，缩合试剂2为1-羟基苯并三氮唑、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑中的一种，缩合试剂3为二异丙基乙胺。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(2)中各试剂的投料摩尔比为：氨基酸：缩合试剂1：缩合试剂2：缩合试剂3：树脂＝3～6：3～6：3～6：6～12。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(2)中各试剂的投料摩尔比为：氨基酸：缩合试剂1：缩合试剂2：缩合试剂3：树脂＝3～6：3～6：3～6：6～12，且N,N-二环己基碳二亚胺或N,N-二异丙基碳二亚胺不与N,N二异丙基乙胺组合使用。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(2)中缩合反应的温度为20～60℃，反应时间为1～4小时。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(3)中的切割试剂为三氟乙酸混合液。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(3)中的切割试剂为三氟乙酸混合液，且混合液中三氟乙酸的体积比不小于80％。在本专利技术的一些实施例中，所述三氟乙酸混合液除了三氟乙酸外还包括重蒸水、三乙基硅烷、1,2二硫苏糖醇、苯酚、苯甲硫醚、碘化铵、三异丙基硅烷、苯甲醚和乙二硫醇中的一种或多种混合。，在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(3)中向保护的奥曲肽-树脂复合物中加入切割试剂进行反应的温度为0～60℃，反应时间为1～4小时。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(3)中的多肽浓度为0.1～1mg/ml，所述的pH范围为7～9。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(3)中氧化剂为空气或双氧水，优选地，氧化剂为双氧水。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(3)中双氧水与还原型奥曲肽粗品的比例为n(还原型奥曲肽粗品)：n(双氧水)＝1：5～10。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(4)的纯化条件为：制备柱填料为碳载硅胶，在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(4)中的流动相为质量比均为0.1％三氟乙酸的水、乙腈或甲醇溶液中的一种或多种混合。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤(4)中的制备柱为C4/C8/C18类型反相色谱柱。本专利技术还提供了一种C端为醇的多肽制备方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种奥曲肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)将Fmoc-Thr-Ol及催化剂加入到醛基树脂中进行缩合反应，得到Fmoc-Thr树脂复合物；/n(2)按照固相多肽合成的方法，根据奥曲肽的序列，将保护氨基酸按C端至N端的顺序逐个偶联到步骤(1)所得树脂上获得保护的奥曲肽-树脂复合物；/n(3)向保护的奥曲肽-树脂复合物中加入切割试剂，将奥曲肽从树脂上裂解下来，得到还原型奥曲肽粗品，将还原型奥曲肽粗品配制成一定的浓度，调节pH，加入氧化剂，反应后得到奥曲肽粗品。/n(4)将奥曲肽粗品分离纯化，得到奥曲肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种奥曲肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将Fmoc-Thr-Ol及催化剂加入到醛基树脂中进行缩合反应，得到Fmoc-Thr树脂复合物；
(2)按照固相多肽合成的方法，根据奥曲肽的序列，将保护氨基酸按C端至N端的顺序逐个偶联到步骤(1)所得树脂上获得保护的奥曲肽-树脂复合物；
(3)向保护的奥曲肽-树脂复合物中加入切割试剂，将奥曲肽从树脂上裂解下来，得到还原型奥曲肽粗品，将还原型奥曲肽粗品配制成一定的浓度，调节pH，加入氧化剂，反应后得到奥曲肽粗品。
(4)将奥曲肽粗品分离纯化，得到奥曲肽。


2.根据权利要求1所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的催化剂为对甲苯磺酸。


3.根据权利要求2所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的醛基树脂为4-苄氧基苯甲醛树脂。


4.根据权利要求3所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的各物质间的比例为n(Fmoc-Thr-Ol)：n(对甲苯磺酸)：n(4-苄氧基苯甲醛树脂)＝1～3：0.1～0.5：1。


5.根据权利要求1所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的Fmoc脱保护试剂是体积比为1：1～4的哌啶与二甲基甲酰胺，所述Fmoc脱保护反应的温度为20～60℃。


6.根据权利要求1所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的缩合试剂为缩合试剂1，缩合试剂2以及缩合试剂3的一种或多种混合；其中，缩合试剂1为N,N-二环己基碳二亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯、卡特缩合剂、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷中的一种，缩合试剂2为1-羟基苯并三氮唑、N-羟...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卫国，王克全，朱家培，
申请(专利权)人：江苏金斯瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32