一种在牛蛙中提取抗肿瘤多肽及分析方法技术

本发明专利技术涉及生物提取技术领域，尤其涉及一种在牛蛙中提取抗肿瘤多肽及分析方法。本申请方案通过牛蛙皮肤cDNA文库中筛选的Temporin‑La（T‑La）抗肿瘤肽，通过检测发现T‑La具有一定的抗肿瘤活性和轻微溶血性。为提高其对肿瘤细胞的靶向性，对牛蛙抗肿瘤肽T‑La氨基酸进行分子改造，合成新的抗肿瘤肽T‑La（FS），并对改造后的多肽T‑La(FS)与RGD偶联，合成对肿瘤细胞具有靶向作用的抗肿瘤肽RGD‑T‑La（FS），通过对其生物信息学进行分析及生物活性检测，前期研究证明RGD‑T‑La（FS）对肿瘤细胞具有较强的抑制作用。

【技术实现步骤摘要】
一种在牛蛙中提取抗肿瘤多肽及分析方法
本专利技术属于生物提取
，具体地说，本专利技术涉及一种在牛蛙中提取抗肿瘤多肽及分析方法。
技术介绍
蛙类细胞提取物以下简称蛙类提取物，尤其针对牛蛙细胞提取，基于靶向嵌合体肽，对小鼠黑色素瘤细胞B16F10的凋亡的影响及黑色素合成的作用机理，研究结果显示：靶向嵌合体肽对于在裸鼠和色素瘤B16F10模型中的靶向治疗作用效果明显；无论是腹腔注射还是灌胃都显著抑制裸小鼠Lewis肺癌的生长和转移，减少肿瘤组织微血管密度，下调促血管生成因子VEGF的表达；对裸小鼠黑色素瘤B16细胞的转移也有强抑制作用。靶向治疗作为抗肿瘤质量方向的目标，将药物效应尽量限定在特定靶细胞、组织或器官内，从而针对正常细胞、器官或者组织功能无影响，而靶向治疗的关键在于找寻或者改变特定蛋白对于肿瘤细胞的抑制活性。在现有技术中，为了提高蛋白的活性，针对蛋白的特异位点进行特异性的突变和取代，从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性，申请人通过大量的实验，针对牛蛙提取突变体，从而获得了比蛙类提取物本身具有更高抑制活性的突变体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题，是针对上述存在的技术不足，提供了一种在牛蛙中提取抗肿瘤多肽及分析方法，具体而言，本专利技术通过牛蛙皮肤cDNA文库中筛选的Temporin-La（T-La）抗肿瘤肽，通过检测发现T-La具有一定的抗肿瘤活性和轻微溶血性。为提高其对肿瘤细胞的靶向性，对牛蛙抗肿瘤肽T-La氨基酸进行分子改造，合成新的抗肿瘤肽T-La（FS），并对改造后的多肽T-La(FS)与RGD偶联，合成对肿瘤细胞具有靶向作用的抗肿瘤肽RGD-T-La（FS），通过对其生物信息学进行分析及生物活性检测，前期研究证明RGD-T-La（FS）对肿瘤细胞具有较强的抑制作用；本专利技术提取的突变体具有明细的抑制活性特点。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：包括小鼠黑色素瘤B16细胞、多肽样品T-La（S）：LLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La(S)：RGDLLRHVVKILSKYL-NH2；T-La（FS）：FLRHVVKILSKYL-NH2;RGD-T-La（FS）：RGDFLRHVVKILSKYL-NH2；CCK8检测试剂盒、RPMI1640细胞培养基、NP-40细胞裂解液、BCA蛋白浓度试剂盒、TritonX-100、左旋多巴L-DOPA、兔抗Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、caspase9多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗及兔抗GAPDH多克隆抗，步骤一：取生长状态最佳的B16细胞常规方法消化成单细胞悬液，将细胞密度调整到7×104~9×104个/mL时以每孔2mL接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2中培养24h后PBS洗涤一次换液，分别加入不同浓度的多肽样品T-La（S）：LLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La(S):RGDLLRHVVKILSKYL-NH2；T-La（FS）：FLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La（FS）:RGDFLRHVVKILSKYL-NH2至单细胞悬液中；将单细胞悬液最终终浓度设置为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，并设立对照组。多肽样品作用24h后收获细胞，消化细胞后将细胞悬浮离心，PBS洗涤两次，加入1mol/L的NaOH，置于80℃水浴30min至细胞团块完全溶解，再加入超纯水将NaOH终浓度稀释至0.2mol/L。混合均匀后取各组溶液至96孔板中，每孔100μL，每组设立8个重孔。用酶标仪在490nm处测定每孔OD值，从而测定黑色素含量，其计算方法为黑色素含量（%）=（OD实验组/OD对照组）×100%；步骤二：取生长状态最佳的B16细胞常规方法消化成单细胞悬液，将细胞密度调整到7×104~9×104个/mL时以每孔100μL接种于96孔板中，置于37℃、5%CO2中培养24h后分别加入不同浓度的多肽样品T-La（S）：LLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La(S):RGDLLRHVVKILSKYL-NH2；T-La（FS）：FLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La（FS）:RGDFLRHVVKILSKYL-NH2至单细胞悬液，将单细胞悬液最终终浓度设置为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，并设立对照组，终体积为200μL，并且每组设置4个重复对照组。药物作用24h弃上清液，用PBS洗涤，每孔加入1%TritonX-100溶液100μL，手动平稳震荡5min，移至-20℃冰箱冻存1h，室温融化使细胞裂解，37℃预温后每孔加入0.1%左旋多巴溶液100μL，37℃孵育2h，用酶标仪在490nm测定OD值，从而测定酪氨酸酶活性激活率，其计算方法为酪氨酸酶活性激活率（%）=（OD实验组/OD对照组）×100%；步骤三：取生长状态最佳的B16细胞常规方法消化成单细胞悬液，将细胞密度调整到7×104~9×104个/mL时以每孔2mL接种于6孔板中，单细胞悬液加入终浓度为20、50μg/mL的多肽样品T-La（S）：LLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La(S):RGDLLRHVVKILSKYL-NH2；T-La（FS）：FLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La（FS）:RGDFLRHVVKILSKYL-NH2，单细胞悬液作用24h后弃培养液，用PBS洗涤2遍加入适当体积的NP-40细胞裂解液4℃裂解1h，用细胞刮将细胞轻轻刮下吸入ep管中放入-80℃冰箱中或立即使用。取上述样品低温离心（12000r/min，5min），取上清，BCA法测总蛋白浓度，按照每个样品50ng总蛋白加入上样缓冲液，煮沸后，进行15%SDS-PAGE电泳后，半干法转至PVDF膜，5%脱脂奶粉4℃孵育过夜，加入定量的兔抗Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、caspase9多克隆抗体和GAPDH一抗，在室温孵育1.5h；加入适量的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育1h，ECL法发光显色；从而制备RGD嵌合体肽。采用图像分析软件系统分析各条带的灰度值，用各目的蛋白的灰度值与GAPDH灰度值的比值进行分析；步骤四：试验结果采用统计学软件SPSSStatistics17对数据进行处理，数据用平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为两组间的差异具有统计学意义。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，探索改造过的RGD嵌合体肽对黑色素瘤B16细胞增殖和凋亡机制做进一步筛选分析，提高其对肿瘤细胞的靶向性，对牛蛙抗肿瘤肽T-La氨基酸进行分子改造，合成新的抗肿瘤肽T-La（FS），并对改造后的多肽T-La(FS)与RGD偶联，合成对肿瘤细胞具有靶向作用的抗肿瘤肽RGD-T-La（FS），通过对其生物信本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在牛蛙中提取抗肿瘤多肽及分析方法，包括小鼠黑色素瘤B16细胞、多肽样品T-La（S）：LLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La(S)：RGDLLRHVVKILSKYL-NH2；T-La（FS）：FLRHVVKILSKYL- NH2; RGD-T-La（FS）：RGDFLRHVVKILSKYL- NH2；CCK8检测试剂盒、RPMI1640细胞培养基、NP-40细胞裂解液、BCA蛋白浓度试剂盒、Triton X-100、左旋多巴L-DOPA、兔抗Cleaved-caspase 3、Bax、Bcl-2、caspase 9多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗及兔抗GAPDH多克隆抗，其特征在于：/n步骤一：取生长状态最佳的B16细胞常规方法消化成单细胞悬液，将细胞密度调整到7×104~9×104个/mL时以每孔2 mL接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2中培养24 h后PBS洗涤一次换液，分别加入不同浓度的多肽样品T-La（S）：LLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La(S):RGDLLRHVVKILSKYL-NH2；T-La（FS）：FLRHVVKILSKYL- NH2； RGD-T-La（FS）:RGDFLRHVVKILSKYL- NH2至单细胞悬液中；将单细胞悬液最终终浓度设置为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL，并设立对照组；多肽样品作用24 h后收获细胞，消化细胞后将细胞悬浮离心，PBS洗涤两次，加入1 mol/L的NaOH，置于80℃水浴30min至细胞团块完全溶解，再加入超纯水将NaOH终浓度稀释至0.2 mol/L；混合均匀后取各组溶液至96孔板中，每孔100 μL，每组设立8个重孔；用酶标仪在490 nm处测定每孔OD值，从而测定黑色素含量，其计算方法为黑色素含量（%）=（OD实验组/OD对照组）×100%；/n步骤二：取生长状态最佳的B16细胞常规方法消化成单细胞悬液，将细胞密度调整到7×104~9×104个/mL时以每孔100 μL接种于96孔板中，置于37℃、5%CO2中培养24 h后分别加入不同浓度的多肽样品T-La（S）：LLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La(S):RGDLLRHVVKILSKYL-NH2；T-La（FS）：FLRHVVKILSKYL- NH2； RGD-T-La（FS）: RGDFLRHVVKILSKYL- NH2至单细胞悬液，将单细胞悬液最终终浓度设置为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL，并设立对照组，终体积为200 μL，并且每组设置4个重复对照组；药物作用24h弃上清液，用PBS洗涤，每孔加入1% Triton X-100溶液100 μL，手动平稳震荡5 min，移至-20℃冰箱冻存1 h，室温融化使细胞裂解，37℃预温后每孔加入0.1%左旋多巴溶液100 μL，37℃孵育2 h，用酶标仪在490 nm测定OD值，从而测定酪氨酸酶活性激活率，其计算方法为酪氨酸酶活性激活率（%）=（OD实验组/OD对照组）×100%；/n步骤三：取生长状态最佳的B16细胞常规方法消化成单细胞悬液，将细胞密度调整到7×104~9×104个/mL时以每孔2 mL接种于6孔板中，单细胞悬液加入终浓度为20、50 μg/mL的多肽样品T-La（S）：LLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La(S):RGDLLRHVVKILSKYL-NH2；T-La（FS）：FLRHVVKILSKYL- NH2； RGD-T-La（FS）: RGDFLRHVVKILSKYL- NH2，单细胞悬液作用24h后弃培养液，用PBS洗涤2遍加入适当体积的NP-40细胞裂解液4 ℃裂解1 h，用细胞刮将细胞轻轻刮下吸入ep管中放入-80℃ 冰箱中或立即使用；取上述样品低温离心（12000 r/min，5 min），取上清，BCA法测总蛋白浓度，按照每个样品50 ng总蛋白加入上样缓冲液，煮沸后，进行15% SDS-PAGE 电泳后，半干法转至PVDF膜，5%脱脂奶粉4℃孵育过夜，加入定量的兔抗Cleaved-caspase 3、Bax、Bcl-2、caspase 9多克隆抗体和GAPDH一抗，在室温孵育1.5 h ；加入适量的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育1 h，ECL法发光显色；从而制备 RGD嵌合体肽；采用图像分析软件系统分析各条带的灰度值，用各目的蛋白的灰度值与GAPDH灰度值的比值进行分析；/n步骤四：试验结果采用统计学软件SPSS Statistics 17 对数据进行处理，数据用平均值±标准差表示，...

【技术特征摘要】
1.一种在牛蛙中提取抗肿瘤多肽及分析方法，包括小鼠黑色素瘤B16细胞、多肽样品T-La（S）：LLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La(S)：RGDLLRHVVKILSKYL-NH2；T-La（FS）：FLRHVVKILSKYL-NH2;RGD-T-La（FS）：RGDFLRHVVKILSKYL-NH2；CCK8检测试剂盒、RPMI1640细胞培养基、NP-40细胞裂解液、BCA蛋白浓度试剂盒、TritonX-100、左旋多巴L-DOPA、兔抗Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、caspase9多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗及兔抗GAPDH多克隆抗，其特征在于：
步骤一：取生长状态最佳的B16细胞常规方法消化成单细胞悬液，将细胞密度调整到7×104~9×104个/mL时以每孔2mL接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2中培养24h后PBS洗涤一次换液，分别加入不同浓度的多肽样品T-La（S）：LLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La(S):RGDLLRHVVKILSKYL-NH2；T-La（FS）：FLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La（FS）:RGDFLRHVVKILSKYL-NH2至单细胞悬液中；将单细胞悬液最终终浓度设置为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，并设立对照组；多肽样品作用24h后收获细胞，消化细胞后将细胞悬浮离心，PBS洗涤两次，加入1mol/L的NaOH，置于80℃水浴30min至细胞团块完全溶解，再加入超纯水将NaOH终浓度稀释至0.2mol/L；混合均匀后取各组溶液至96孔板中，每孔100μL，每组设立8个重孔；用酶标仪在490nm处测定每孔OD值，从而测定黑色素含量，其计算方法为黑色素含量（%）=（OD实验组/OD对照组）×100%；
步骤二：取生长状态最佳的B16细胞常规方法消化成单细胞悬液，将细胞密度调整到7×104~9×104个/mL时以每孔100μL接种于96孔板中，置于37℃、5%CO2中培养24h后分别加入不同浓度的多肽样品T-La（S）：LLRHVVKILSKYL-NH2；RGD-T-La(S):RGDLLRHVVKILSKYL-NH2；T-La（FS）：FLRHV...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵瑞利，金天明，杨琳燕，姜轩，马吉飞，李留安，秦顺义，李存，付超，胡烨，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津;12