一类对称短序列抗菌肽类似物及其应用制造技术

本发明专利技术设计合成了一类对称短序列抗菌肽类似物，其以三个色氨酸“WWW”为镜面对称中心，两侧分别引入正电荷性的精氨酸和疏水性氨基酸，然后进行C末端酰胺化得到，其结构通式为：XYWWWYX‑NH

【技术实现步骤摘要】
一类对称短序列抗菌肽类似物及其应用
本专利技术属于生物化学
，涉及一类对称短序列抗菌肽类似物，本专利技术同时还涉及该类抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物中的应用。
技术介绍
抗生素的滥用和过度使用，以及新型小分子抗生素的未能及时发现，导致抗生素危机的爆发，出现了对几乎所有可用抗生素都具有耐药性的“超级细菌”(LancetInfectDis.2013Dec；13(12):1057-98)。目前，全世界每年约有70万人死于抗生素耐药。预计未来几年这一现象将越发严重，抗生素耐药将成为世界范围内的主要死亡原因，到2050年估计每年约有1000万人死于抗生素耐药。抗菌肽(AMPs，Antimicrobialpeptides)作为一种小分子活性肽，广泛存在于昆虫、动物、微生物等有机生物体中。抗菌肽具有较强的广谱抗菌活性，例如早期发现的抗菌肽Melittin，Cecropin和Magainin，均能够有效的对抗细菌(BiophysJ.2016Jul12；111(1):132-9；PLoSComputBiol.2016Jan4；12(1):e1004570；PLoSOne.2017Nov29；12(11):e0187914)。相比于通过单一的、特殊的分子靶标作用的抗生素，抗菌肽由于其非受体介导的膜机制，同时具有例如与细菌DNA、RNA、核酸结合，影响蛋白质的合成等多种作用机制，而表现出较低的耐药发生性，且抗菌肽在对抗正常菌株的同时，对耐药性菌株也表现出很好的抗菌活性(CurrMedChem.2014；21(20):2299-321)。虽然抗菌肽作为一种新型抗菌药物，为对抗细菌耐药提供了希望和机会，但由于系统毒性、抗菌活性欠佳，由于复杂的设计导致的高生产成本等问题，使其在临床的应用与发展受到了限制(NatBiotechnol.2005Aug；23(8):1008-12)。与复杂的常见多肽修饰方法不同，“镜面对称设计”作为一种新的多肽设计策略，近年来获得了一定成效。2005年，Sung-TaeYang等人采用色氨酸(W)富集肽Tritrpticin(VRRFPWWWPFLRR-COOH)的中心片段WWW，采用镜像对称设计理念，设计得到了具有理想抗菌活性的抗菌肽类似物PST11-RK(KKFPWWWPFKK-NH2)和PST13-RK(KKKFPWWWPFKKK-NH2)(IntJAntimicrobAgents.2006Apr；27(4):325-30)。东北农业大学一课题组曾报道了镜面对称抗菌肽KL4A6，其序列组成为LLKAAAKAAAKLL-NH2，具有较好的细菌选择性，但抗菌谱较窄；接着，该课题组以KAAAKAAAK为镜面中心，将序列的两端同时引入其他氨基酸，并以色氨酸做末端，得到了一系列类似物WXKAAAKAAAKXW，其中X＝V、I、F或W，显著提高了抗菌活性、扩大了抗菌谱(AminoAcids.2016Feb；48(2):403-17.；IntJMolSci.2019Mar20；20(6))。以上关于抗菌肽类似物的研究虽然收效显著，但仍然存在因序列长、设计复杂而造成制造成本高的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一类设计简单、制造成本低、抗菌活性强、低溶血毒性和低耐药发生性的对称短序列抗菌肽类似物。本专利技术的另一目的是提供上述对称短序列抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一、一类对称短序列抗菌肽类似物的结构设计本专利技术涉及的一类对称短序列抗菌肽类似物，是以三个色氨酸“WWW”为镜面对称中心，在其两侧分别引入正电荷氨基酸Y和疏水性氨基酸X，然后进行C末端酰胺化得到，其结构通式为：XYWWWYX-NH2，标记为XYW；或XWYWWWYWX-NH2，标记为XWYW；或XYYWWWYYX-NH2，标记为XYYW；其中X＝G、I、L、F、W、V、A；Y＝R。具体地，本专利技术所述的一类对称短序列抗菌肽类似物，其结构式如下：X-Y-Trp-Trp-Trp-Y-X-NH2，标记为XYW；X-Trp-Y-Trp-Trp-Trp-Y-Trp-X-NH2，标记为XWYW；X-Y-Y-Trp-Trp-Trp-Y-Y-X-NH2，标记为XYYW；其中，X＝Gly，Leu，Ile，Phe，Trp，Val，Ala，Y＝Arg；作为本专利技术技术方案的优选，上述抗菌肽类似物包括WRW，GWRW，IWRW，AWRW，VWRW，LRRW和FRRW，其氨基酸序列分别如SEQIDNo.1至SEQIDNo.7所示。上述对称短序列抗菌肽类似物均采用经典固相合成法制备得到。二、一类对称短序列抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物中的应用1、体外抗菌实验采用微量二倍稀释法测定上述对称短序列抗菌肽类似物对实验菌株的最低抑菌浓度(MIC)，评估其抗菌活性。所选用的实验菌株包括：革兰氏阴性菌(E.coliATCC25922，P.aeruginosATCC27853，A.baumanniiATCC19606)，革兰氏阳性菌(S.aureusATCC25923，S.epidermidisATCC12228,B.subtilisATCC23857)。具体实验方法为：用MH肉汤培养基将生长至对数中期的实验细菌稀释成1×106CFU/mL的细菌悬浮液；将抗菌肽类似物溶解于无菌水，经二倍稀释法用培养基配制成一系列不同浓度的抗菌肽类似物溶液，再将其与等体积细菌悬浮液混合，加于96孔培养板中37℃孵育18-24h观察，无明显细菌生长的最小浓度即为抗菌肽类似物的最低抑菌浓度(MIC)。上述实验以抗生素Gentamicin作阳性对照平行重复三次，结果如表1。表1本专利技术抗菌肽类似物对抗标准菌株的最低抑菌浓度表1结果表明，本专利技术对称短序列抗菌肽类似物对常见实验菌株均具有较强的抗菌活性。2、溶血实验取健康的新鲜小鼠血液，1000g离心10min(4℃)，弃去上层血清，用PBS(10mM，pH7.4)清洗下层血细胞后，将其配制成含有8％血细胞的悬浮液，加于96孔板中；将抗菌肽类似物溶解于PBS中，用二倍稀释法配制成256-2μmol/L不同浓度的肽溶液，将其等体积加于已加入血细胞悬浮液的96孔板中，37℃孵育1h；共孵物1200g离心15min后，将上清液转移至新的96孔板，酶标仪检测其490nm处的吸光值；PBS空白溶液作阴性对照，1％TritonX-100作阳性对照，根据公式：Hemolysisrate(％)＝[(OD490nmpeptides-OD490nmnegativecontrol)/(OD490nmpositivecontrol-OD490nmnegativecontrol)]×100％，计算溶血率，结果如图8。图8结果表明，本专利技术对称短序列抗菌肽类似物具有低的溶血毒性，除了抗菌肽类似物IWRW、AWRW和VWRW在较高检测浓度表现出溶血毒性，但其溶血发生浓度远大本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一类对称短序列抗菌肽类似物，其特征是，所述抗菌肽类似物是以三个色氨酸“WWW”为镜面对称中心，在其两侧分别引入正电荷氨基酸Y和疏水性氨基酸X，然后进行C末端酰胺化得到，其结构通式为：/nXYWWWYX-NH

【技术特征摘要】
1.一类对称短序列抗菌肽类似物，其特征是，所述抗菌肽类似物是以三个色氨酸“WWW”为镜面对称中心，在其两侧分别引入正电荷氨基酸Y和疏水性氨基酸X，然后进行C末端酰胺化得到，其结构通式为：
XYWWWYX-NH2，标记为XYW；
或XWYWWWYWX-NH2，标记为XWYW；
或XYYWWWYYX-NH2，标记为XYYW；
其中X＝G、I、...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪京满，王锐，钟超，王一杰，
申请(专利权)人：倪京满，王锐，
类型：发明
国别省市：甘肃;62