具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽2KRI4W及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一类具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽，该α螺旋抗菌短肽是以α螺旋多肽为结构基础，引入含带正电荷氨基酸或中性亲水性氨基酸，以及疏水性不含硫氨基酸得到的两亲性α螺旋抗菌短肽，其结构通式为：XYYXXYXXYY

【技术实现步骤摘要】
具有高抗菌活性、低毒性的
α
螺旋抗菌短肽2KRI4W及其应用


[0001]本专利技术属于生物化学
，涉及一类具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽，本专利技术同时还涉及该α螺旋抗菌短肽的应用。

技术介绍

[0002]联合国2019年4月29日发布的耐药报告显示，抗生素耐药性问题日益严重，如不立即采取应对措施，到2050年，抗生素耐药性疾病每年可能造成1000万人死亡，对经济的破坏或相当于2008年的全球金融危机。我国卫健委2019年发布的《中国临床抗菌药物管理和细菌耐药现状报告》显示，碳青霉烯类耐药菌检出率呈现上升趋势，原因是碳青霉烯类临床抗菌药物的过度使用。目前，大部分抗生素对“超级细菌”不起作用，“超级细菌”对人类健康已造成极大的危害。而这些超级耐药细菌有扩散到世界各地的趋势，世界急切呼唤新型临床抗菌药物。
[0003]大多数抗生素通过干扰细胞壁、蛋白质、核酸的生物合成或代谢功能的途径来攻击细菌。细菌很容易通过发展生化溶液来对抗这些特定的过程而进化出对抗生素的耐受能力，从而产生耐药性。抗菌肽是生物体免疫防御系统的重要组成部分，可直接作用于菌膜造成物理性损伤，其有多种杀菌机制，且能与免疫系统相互作用，对多重耐药菌表现出显著杀伤作用，可以快速地杀灭微生物。由于细菌表面的结构和带电性能无法改变，因此很难产生耐药性。它与传统抗生素联用具有协同增效的作用，既降低了抗生素的用量又降低了抗菌肽的用量，同时还可以减缓抗生素耐药速度以及逆转抗生素耐药性，避免资源的浪费，因此抗菌肽的研发有望应对抗生素耐药危机。
[0004]目前为止，已经有上千种天然抗菌肽被分离出来，其空间结构分为α螺旋、β折叠、环形、伸展型以及无规律型和复合型结构等。天然或传统的多肽类抗生素一般稳定性差，生物半衰期短，生物利用率低，且有一定的毒性。因此，设计合成具有高稳定性、低毒的新型长效抗菌肽具有重要意义。β折叠、环形等抗菌肽主要以二级结构为基础发挥抗菌活性。而α螺旋型抗菌肽由于结构简单，其发挥活性不仅依靠两亲性α螺旋结构，氨基酸的组成和排列方式对其发挥活性更加重要，尤其对于短序列α螺旋抗菌肽，氨基酸的选择和排列组合方式对其活性影响很大，选择疏水性一般的氨基酸和多引入带正电荷氨基酸，亲水性太强，难以平衡两亲性，选择高疏水性氨基酸和少引入带正电荷氨基酸，疏水性太强，要么肽在水环境中难以溶解，要么分子易发生团聚，不能通过细胞膜而不产生抗菌活性。因此，合适的氨基酸种类、数目、排列方式决定了α螺旋抗菌短肽的二级结构、疏水性、两亲性、跨膜能力和抗菌活性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一是提供一类具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽。
[0006]本专利技术的目的之二是提供上述α螺旋抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
一、具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽的设计本专利技术具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽，是以α螺旋多肽为结构基础，引入含带正电荷氨基酸或中性亲水性氨基酸，以及疏水性不含硫氨基酸得到的两亲性α螺旋抗菌短肽，其结构通式为：XYYXXYXXYY
‑
NH2，其中，X为带正电荷或中性亲水性氨基酸，Y为疏水性不含硫氨基酸。
[0008]作为本专利技术技术方案的优选，上述α螺旋抗菌短肽包括5K5W，2KRI4W，KR5W，3RI4F，其氨基酸序列如下：Lys
‑
Trp
‑
Trp
‑
Lys
‑
Lys
‑
Trp
‑
Lys
‑
Lys
‑
Trp
‑
Trp
‑
NH2，标记为5K5W（SEQ ID No.1）；Gly
‑
Trp
‑
Trp
‑
Lys
‑
Arg
‑
Ile
‑
Lys
‑
Thr
‑
Trp
‑
Trp
‑
NH2，标记为2KRI4W（SEQ ID No.2）；Lys
‑
Trp
‑
Trp
‑
Lys
‑
Arg
‑
Trp
‑
Lys
‑
Lys
‑
Trp
‑
Trp
‑
NH2，标记为4KR5W（SEQ ID No.3）；Gly
‑
Phe
‑
Phe
‑
Arg
‑
Arg
‑
Ile
‑
Arg
‑
Thr
‑
Phe
‑
Phe
‑
NH2，标记为3RI4F（SEQ ID No.4）。
[0009]上述α螺旋抗菌短肽均采用经典的多肽Fmoc固相合成法制备得到，具体为：以Rink
‑
MBHA Resin为原料，在多肽合成过程中以HOBt/HBTU作为缩合剂进行氨基酸耦合，采用茚三酮显色法检定二级胺，按照多肽序列依次耦合即得连有MBHA树脂的多肽，多肽切割及HPLC纯化后得到α螺旋抗菌短肽。
[0010]二、具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用1、体外抑菌实验采用经典微量连续二倍稀释法测定本专利技术α螺旋抗菌短肽对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌）及革兰氏阴性菌（铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌）的最小抑菌浓度；以抗生素Gentamicin、Kanamycin、Vancomycin、Rifampin、Polymyxin B作为阳性对照。实验平行重复3次，结果见表1和表2。
[0011]表1本专利技术α螺旋抗菌短肽对革兰氏阳性菌菌株的最低抑菌浓度
[0012]表2本专利技术α螺旋抗菌短肽对革兰氏阴性菌菌株的最低抑菌浓度
[0013]表1和2结果显示，本专利技术α螺旋抗菌短肽对以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为代表的革兰氏阳性菌，和以大肠杆菌、铜绿假单胞菌为代表的革兰氏阴性菌都具有较强抑制作用，表现为广谱抗菌活性，5K5W抗革兰氏阴性菌效果与抗生素Polymyxin B较相近，抗革兰氏阳性菌效果要强于Polymyxin B。
[0014]2、溶血活性实验为了考察本专利技术合成的α螺旋抗菌短肽对正常哺乳动物细胞的毒性，测定了α螺旋抗菌短肽与小鼠红细胞孵育1h后的溶血情况，结果见图5。
[0015]图5结果显示，2KRI4W的10%溶血浓度为103.54 μM，5K5W的10%溶血浓度为134.38 μM，4KR5W的10%溶血浓度为77.65 μM，远高于其对革兰氏阴性菌和阳性菌的MIC。3RI4F10%溶血浓度远大于256 μM，没有表现出溶血毒性。说明本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽，其特征在于，所述抗菌短肽是以α螺旋多肽为结构基础，引入带正电荷氨基酸，以及疏水性不含硫氨基酸得到的两亲性α螺旋抗菌短肽，其结构通式为：XYYXXYXXYY
‑
NH2；所述抗菌短肽为2KRI4W，其氨基酸序列如SEQ ID No.1。2.如权利要求1所述的具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪京满，王锐，缑三虎，
申请(专利权)人：倪京满，
类型：发明
国别省市：