切割非神经元SNARE的肉毒杆菌神经毒素制造技术

本发明专利技术提供了相对于未经修饰的(野生型)BoNT/A L链蛋白酶，显示对人SNAP‑23(hSNAP‑23)的切割增强的经修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)L链蛋白酶，及其在切割hSNAP‑23中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】切割非神经元SNARE的肉毒杆菌神经毒素介绍本专利技术涉及经修饰的具有切割非神经元SNARE蛋白能力的肉毒杆菌神经毒素(botulinumneurotoxin)蛋白酶，及其在通过切割哺乳动物细胞中的非神经元SNARE蛋白来抑制所不希望的从该哺乳动物细胞分泌中的用途。毒素通常落入两种类型之一，即杀伤其天然靶细胞的细胞毒性毒素(例如植物毒素，如蓖麻毒蛋白)和不杀伤其天然靶细胞的非细胞毒性毒素(例如肉毒杆菌神经毒素)。非细胞毒性毒素通过抑制蛋白质合成以外的细胞过程来施加其对靶细胞的作用。肉毒杆菌神经毒素蛋白酶通过蛋白水解切割称为SNARE蛋白的胞内转运蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)发挥作用。首字母缩略词SNARE源自术语可溶性NSF附着蛋白受体(SolubleNSFAttachmentproteinReceptor)，其中NSF指N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ethylmaleimide-SensitiveFactor)。SNARE蛋白是一个大的蛋白质超家族。SNARE蛋白的重要功能是介导神经递质分子胞吐至突触后连接。SNARE蛋白因此是通过小泡运输从细胞分泌分子所不可或缺的。肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)产生在血清学上通过抗血清交叉血清型中和的缺乏来区分的七种(A至G)不同的神经毒素(BoNT)。BoNT通过靶向神经元并切割神经元特异性SNARE蛋白引出神经元特异性松弛性瘫痪。BoNT具有150kDa的多肽链，包含通过二硫键连接的100kDa重链和50kDa轻链。BoNT组织为三个功能结构域：N端蛋白水解轻链(L链)和C端重链(H链)，后者由易位结构域(HN)和C端神经元结合结构域(HC)组成。BoNT的毒性作用(神经中毒)遵循3步作用机制。第一步，HC部分结合胆碱能神经细胞，并通过受体介导的胞吞作用内化。第二步，HN部分使L链易位跨过内体膜，进入神经细胞的胞质溶胶。第三步，L链结合并切割胞质溶胶内的神经元SNARE蛋白，由此抑制神经递质从神经细胞释放，导致神经细胞中毒。七种BoNT血清型切割三种SNARE蛋白之一上的特定残基：血清型B、D、F和G切割VAMP-2；血清型A和E切割SNAP-25；和血清型C切割SNAP-25和突触融合蛋白la。虽然天然BoNT能够靶向并切割神经元SNARE同工型如VAMP-2、SNAP-25和突触融合蛋白la，但所述蛋白酶对大多数非神经元SNARE蛋白的切割作用很小或无切割作用。这种神经元SNARE底物特异性与BoNT所显示的天然神经元细胞结合特异性一致，理解为是BoNT所显示的天然神经元细胞结合特异性的反映。例如，BoNT/A切割人SNAP-25，但不切割人非神经元同工型。早在1989年，BoNT/A就被FDA批准用于治疗斜视、睑痉挛和偏侧面肌痉挛，然后用于颈部肌张力障碍、美容用途、眉间面线和腋窝多汗。BoNT/A在肌张力障碍和其他与非自主性骨骼肌活动相关的障碍中的有效性以及令人满意的安全性特征激起了在多种分泌和疼痛及美容障碍(cosmeticdisorders)中的经验性/标签外使用。BoNT的临床应用集中在靶向神经肌肉活性相关障碍。最近，由SyntaxinLtd领导的开拓性研究已允许设计结合独特亚群的神经元(例如伤害性传入－参见WO96/33273，在此以其整体引入)和/或结合非神经元细胞(例如气道上皮细胞－参见WO00/10598，在此以其整体引入)的重靶向BoNT。此技术称为靶向分泌抑制剂(TSI)技术，涉及用不同的靶向部分(例如生长因子或其他信号分子)替换天然BoNT结合结构域，打开了新的基于BoNT的治疗剂和治疗的大门。但是，BoNT对神经元特异性SNARE蛋白的选择性切割限制了在这些非神经元系统中开发新疗法。认为神经元和非神经元SNARE蛋白对胞内小泡融合并因此对通过小泡运输从细胞分泌分子同等重要。因此，用常规基于BoNT的治疗剂失活神经元SNARE蛋白驱动的分泌将不涉及任何相应的非神经元SNARE驱动的细胞分泌。因此，存在对改造的有效切割非神经元SNARE蛋白的BoNTL链蛋白酶的需要。本专利技术通过提供改造的切割主要在非神经元细胞中表达的SNARE蛋白同工型(即人SNAP-23(hSNAP-23))的BoNT/AL链蛋白酶来解决以上问题中的一个或多个。本专利技术因此提供一类新的非细胞毒性治疗剂。专利技术详述除非本文中另有定义，结合本专利技术使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另有要求，本文中所用的命名及细胞和组织培养技术是本领域公知且常用的那些。但是，对于本说明书通篇使用的不同术语，以下定义尤其更适用。除非文中另有说明，单数术语“一”、“一个”或“该”涵盖复数含义，如“一个或多个”、或“至少一个”。术语“蛋白酶”在本文中指这样的酶，其能够水解切割蛋白质和/或肽。在本专利技术的背景中，该蛋白酶更具体地是肉毒杆菌神经毒素(BoNT)轻链(L-链)蛋白酶，即衍生自肉毒杆菌神经毒素，尤其是衍生自肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)的蛋白酶(也描述为蛋白水解结构域)。如熟练的从业者公知，肉毒杆菌神经毒素的轻链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶功能)，通常具有约50kDa的分子量。这类非细胞毒性蛋白酶通常通过蛋白水解切割称为SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)的胞内转运蛋白发挥作用－参见GeraldK(2002)"CellandMolecularBiology”(第4版)JohnWiley&Sons,Inc.。如下文进一步解释，天然存在(即野生型)的BoNT/AL链更尤其能够有效切割SNAP-25，但仅能微弱切割hSNAP-23。相反，下文更详细描述的本专利技术的BoNT/AL链蛋白酶与天然存在的BoNT/AL链的不同在于，它具有改善的切割hSNAP-23的能力，在本文中称为“经修饰的切割hSNAP-23的BoNT/AL链”。切割hSNAP23的能力可以通过常规测定法确认，如下文实施例2中所述的测定法。“切割hSNAP23”在本文中更尤其指本专利技术的经修饰的BoNT/AL链相对于野生型BoNT/AL链(SEQIDNO:1)显示改善的hSNAP-23切割。可以利用任何简单的比较测定法，如实施例2中所列举的hSNAP-23测定法。野生型BoNT/AL链仅能够进行微弱(即背景)的hSNAP-23切割。因此，本专利技术的经修饰的BoNT/AL链显示以下一项或多项(优选二者)：a)在无细胞测定法(1微摩尔经修饰的BoNT/AL链；20微摩尔hSNAP-23；优选在约37℃孵育约1小时)中hSNAP-23切割大于0.2％(例如大于0.5％，优选大于1％，更优选大于5％)－参见实施例2，图1；和/或b)在无细胞测定法(1微摩尔经修饰的BoNT/AL链；20微摩尔hSNAP-23；优选在约37℃孵育约1小时)中Km小于225(例如小于200，优选小于150)微摩尔－参见实施例2，图1；和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.经修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)L链蛋白酶，其切割人SNAP-23(hSNAP-23)，且相对于野生型BoNT/A L链(SEQ ID NO:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：/na)定位于用于结合hSNAP-23的P182/D178结合位点的第一BoNT/A L链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；和/nb)其中所述第一BoNT/A L链蛋白酶结合袋定义为野生型BoNT/A L链(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基E148、T307、A308和Y312；/nc)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：/ni.经修饰的L链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型BoNT/A L链(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基E148的位置处选自天冬酰胺和酪氨酸的氨基酸残基；和/或/nii.经修饰的L链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型BoNT/A L链(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基T307的位置处选自苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的氨基酸残基；和/或/niii.经修饰的L链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型BoNT/A L链(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基A308的位置处选自脯氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸的氨基酸残基；和/或/niv.经修饰的L链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型BoNT/A L链(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基Y312的位置处选自赖氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸残基。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180129 EP 18153941.21.经修饰的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)L链蛋白酶，其切割人SNAP-23(hSNAP-23)，且相对于野生型BoNT/AL链(SEQIDNO:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位于用于结合hSNAP-23的P182/D178结合位点的第一BoNT/AL链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；和
b)其中所述第一BoNT/AL链蛋白酶结合袋定义为野生型BoNT/AL链(SEQIDNO:1)的氨基酸残基E148、T307、A308和Y312；
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的L链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型BoNT/AL链(SEQIDNO:1)的氨基酸残基E148的位置处选自天冬酰胺和酪氨酸的氨基酸残基；和/或
ii.经修饰的L链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型BoNT/AL链(SEQIDNO:1)的氨基酸残基T307的位置处选自苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的氨基酸残基；和/或
iii.经修饰的L链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型BoNT/AL链(SEQIDNO:1)的氨基酸残基A308的位置处选自脯氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸的氨基酸残基；和/或
iv.经修饰的L链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型BoNT/AL链(SEQIDNO:1)的氨基酸残基Y312的位置处选自赖氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸残基。


2.根据权利要求1所述的经修饰的BoNT/AL链蛋白酶，其进一步包含：
a)定位在用于结合hSNAP-23的D189/D192结合位点的第二BoNT/AL链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第二BoNT/AL链蛋白酶结合袋定义为野生型BoNT/AL链(SEQIDNO:1)的氨基酸残基Q29；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的L链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型BoNT/AL链(SEQIDNO:1)的氨基酸残基Q29的位置处选自丙氨酸的氨基酸残基。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的经修饰的BoNT/AL链蛋白酶，其进一步包含：
a)定位在用于结合hSNAP-23的I198结合位点的第三BoNT/AL链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第三BoNT/AL链蛋白酶结合袋定义为野生型BoNT/AL链(SEQIDNO:1)的氨基酸残基K166；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的L链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型BoNT/AL链(SEQIDNO:1)的氨基酸残基K166的位置处选自缬氨酸的氨基酸残基。


4.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的BoNT/AL链蛋白酶，其进一步包含：
a)定位在用于结合hSNAP-23的K185结合位点的第四BoNT/AL链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第四BoNT/AL链蛋白酶结合袋...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·宾兹，S·西科拉，
申请(专利权)人：益普生生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB