一种体液游离DNA的文库构建方法及其应用技术

一种对体液样本游离DNA进行文库构建的方法，包括利用转座酶或内切酶直接作用于体液样本，将其中游离DNA片段化，然后进行扩增获得文库。还提供了利用该方法进行产前诊断或癌症早期发现的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种体液游离DNA的文库构建方法及其应用
本专利技术涉及测序
，尤其涉及一种体液游离DNA的文库构建方法及其在产前诊断及癌症早期发现中的用途。
技术介绍
1948年，法国科学家曼德尔和麦特斯首次在人体外周血中检测到游离于细胞外的DNA片段。这些DNA主要源于凋亡或坏死细胞被切割后的片段化染色质。1997年，来自香港中文大学的卢煜明研究团队发现，在怀孕母亲的外周血中存在胎儿的血液游离DNA，由此开启了孕妇外周血基因检测的大门。孕妇外周血的基因检测技术称为无创产前诊断技术，其原理为：怀孕的母亲的外周血中存在胎儿的DNA，可以对怀孕母亲的血液游离DNA进行建库测序，并通过对比与母亲DNA的单核苷酸多态性差异分离出胎儿的DNA，从而进行产前诊断(Lo et al，Am.J.Hum.Genet 64，218-224(1999))。目前这项技术在国内外均比较成熟，主要筛查常见的三大染色体疾病，分别是T21染色体异常(唐氏综合征)，T18染色体异常(爱德华氏综合征)和T13染色体异常(帕陶氏综合征)，检测准确率高达99％以上。另外，里昂等人确定了癌症病人的血液游离DNA水平与恶性肿瘤的转移程度存在着某种相关性，为癌症的无创诊断提供了理论基础。进而衍生了癌症早期检测技术：在癌症的病理状态下，由于凋亡和坏死细胞数量增多，因此释放到血液中的游离DNA数量明显增加；这些DNA自身携带癌细胞特有的突变，因此能通过检查血液游离DNA的浓度或突变状态，判断癌症类型以及发展进程(Morelli et al.，Ann Oncol 26，731-736(2015))。并且，在癌症患者血液游离DNA上相继检测到了K-ras，EGFR等基因的突变，这些发现能够应用于肺癌及乳腺癌等恶性肿瘤的早期诊断。应当注意的是，人体包含400多种细胞类型，每种细胞虽然具有相同的一套基因组，但它们的基因表达水平具有显著的细胞特异性。这是由细胞特异性的表观基因组来调控的，表观基因组信息包括DNA甲基化，组蛋白修饰，核小体定位等，通过这些信息并借助细胞参考表观基因组数据库可以直接判断细胞的来源。最新的研究表明，血液游离DNA中隐含表观信息，包括甲基化和核小体定位，因此能够用来进行组织溯源。其中，血液游离DNA的甲基化能在一定程度上反映来源组织细胞的甲基化水平，而不同类型的组织细胞甲基化程度和位置均不相同，因此可以用于判断游离DNA来自哪种细胞类型。例如，Lo等人报道了血液游离DNA甲基化检测技术：血液游离DNA携带其来源细胞的甲基化状态，因此能够用重亚硫酸盐处理后进行建库测序，通过对血液游离DNA的甲基化分析，可以将其对应到特定的细胞类型上去，从而实现组织溯源(Lo et al.，PNAS 112：5503-5512(2015))。这项研究可用于多种诊断当中，包括产前诊断、癌症定位及肿瘤细胞的转移情况诊断、器官移植患者免疫系统排异性诊断等。但是该方法存在以下弊端：(1)基因组上甲基化位点较少，且血液游离DNA本身浓度就低，因此检测结果往往精确性不高；(2)甲基化测序步骤繁琐，可能会导致大量DNA甲基化信息丢失，产生测序质量低，噪音严重等后果。此外，细胞中的核小体定位信息可以用来区分细胞和组织类型。大量文献报道，血液游离DNA的长度多集中在167bp左右，这与一个核小体DNA的长度相符合，表明大量血液游离DNA是由核小体包裹的DNA。2016年，Jay Shendure等人通过提取血液中的游离DNA之后，构建测序文库，并采用深度测序策略，将血液游离DNA的核小体信息定位到不同类型的细胞中，进而实现组织溯源(Shendure et al.，CELL 164，57-68(2016)；Speicher et al.，Nature Genetics 48，1273-1278(2016))。但该方法直接提取血液中的游离DNA进行建库，然后使用血液游离DNA的测序数据来分析核小体定位，而血液中存在的裸露DNA会产生噪音，干扰正常核小体DNA的定位，最终导致组织溯源效率不高；并且，该方法采用深度测序策略，使得测序成本过高，在商业化上难以形成广泛的应用。另外，还有研究报导了专门针对染色质开放区域的染色质开放性测序技术：通过对细胞进行裂解和Tn5转座酶处理，在染色质中开放区域插入测序接头，然后通过PCR扩增的方法进行全部开放染色质区域的扩增，并进行建库和测序(Chang et al.，Curr.Protoc.Mol.Biol.109：21.29.1-21.29.9)。但是，该技术恰恰是排除了核小体DNA的信息，因此同样不能根据核小体DNA进行组织溯源。总之，目前常规的无创产前诊断以及癌症早期检测，是通过先提取血液游离DNA、然后进行常规建库来完成，其存在以下问题：(1)血液游离DNA的含量很低，在建库过程中非常容易带来损失，导致建库失败或者检测灵敏度不高；(2)现有的建库方法都是直接提取血液中的游离DNA，再对提取后的DNA进行建库测序。最终只能得到血液游离DNA的序列或甲基化信息，而核小体分布信息可能会在建库的过程中丢失。(3)测序成本过高。因此，亟待开发出一种高效、灵敏的血液游离DNA建库方法，并且能够用这种方法筛选出血液游离DNA的核小体片段，进行组织溯源。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的缺陷，本专利技术旨在提供一种对体液游离DNA进行文库构建的方法，及其在产前诊断及癌症早期发现中的用途。本专利技术使用酶直接攻击体液，以对其中的游离DNA进行片段化并添加接头，而无需从体液中提取游离DNA，其步骤简单，建库成本低，不仅可以实现体液游离DNA的微量建库策略，而且在建库过程中最大限度保留了体液游离核小体DNA的片段信息。本专利技术是通过如下技术方案实现上述目标的。一方面，本专利技术提供了一种对体液样本游离DNA进行文库构建的方法，其包括：(1)用酶直接作用于体液样本，以将体液样本中的游离DNA片段化；(2)对步骤1)所得片段化的DNA进行扩增，获得体液游离DNA文库。在优选的具体实施方案中，所述体液选自血液、尿液、唾液的至少一种。在所述体液样本中，游离DNA有两种：一种是与组蛋白结合在一起的核小体DNA，一种是无结合的裸露DNA。在酶作用之后，裸露DNA会被切割成大约50bp的片段，而核小体DNA由于与组蛋白结合，其被切割成的片段可能会大一些。在优选的具体实施方案中，所述酶为转座酶或内切酶；优选地，所述转座酶为Tn5转座酶，所述内切酶为MNase或DNase酶。请注意，无论是转座酶还是内切酶，都可以直接作用于体液样本，区别在于：使用转座酶直接进行体液攻击的实施方案可以直接完成DNA片段化与加接头两者，而使用内切酶的实施方案仅能完成片段化，添加接头的步骤需要后续单独进行。在优选的具体实施方案中，步骤(1)包括：利用转座酶，对含有游离DNA的体液样本进行转座反应，以将所述游离DNA进行片段化并添加接头序列，获得包含接头序列的DNA片段；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对体液样本游离DNA进行文库构建的方法，其包括：/n(1)用酶直接作用于体液样本，以将体液样本中的游离DNA片段化；/n(2)对步骤1)所得片段化的DNA进行扩增，获得体液游离DNA文库。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种对体液样本游离DNA进行文库构建的方法，其包括：
(1)用酶直接作用于体液样本，以将体液样本中的游离DNA片段化；
(2)对步骤1)所得片段化的DNA进行扩增，获得体液游离DNA文库。


根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述酶为转座酶或内切酶。


根据权利要求2所述的方法，其中，所述转座酶为Tn5转座酶，所述内切酶为MNase或DNase酶。


根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)包括：利用转座酶，对含有游离DNA的体液样本进行转座反应，以将所述游离DNA进行片段化并添加接头序列，获得包含接头序列的DNA片段；
优选地，步骤(1)还包括：在将所述游离DNA进行片段化并添加接头序列之后，进行核酸提取的步骤。


根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)包括：利用内切酶处理含有游离DNA的体液样本，以将所述游离DNA进行片段化，然后在所得片段化DNA的两端添加接头序列，获得包含接头序列的DNA片段；
优选地，步骤(1)还包括：在将所述游离DNA进行片段化之后，进行核酸提取的步骤。


根据权利要求4所述的方法，其中，用于所述转座反应的接头为接头混合物，其通过以下步骤制备：
1)将引物A：5′-CTGTCTCTTATACACATCT-3′与引物B：5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′退火，得退火产物1；
2)将引物A：5′-CTGTCTCTTATACACATCT-3′与引物C：5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′退火，得退火产物2；
3)将退火产物1和退火产物2混合，得接头混合物；

优选地，所述接头混合物与所述转座酶进行包埋，获得转座酶包埋复合物，以用于转座反应；
进一步优选地，将所述接头混合物与包含转座酶的Tagment Enzyme Advanced V5S进行包埋；优选地，所述接头混合物与所述Tagment Enzyme Advanced V5S的体积比为1∶20-1∶25、优选为1∶24.5；优选地，所述包埋在22-28℃、优选在25℃下进行40-80min、优选60min。


根据权利要求6所述的方法，其中，将所述转座酶包埋复合物与所述体液样本在转座反应条件下进行孵育，以实现转座反应；
对于所述转座反应，优选地，所述转座酶包埋复合物与所述体液样本的体积比为1∶50-1∶80，优选为1∶62....

【专利技术属性】
技术研发人员：王明月，刘龙奇，刘传宇，吴亮，许江山，袁月，商周春，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44