一种用于构建同时实现基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的测序文库的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于构建DNA测序文库的方法和试剂盒。更具体地，本发明专利技术提供一种用于构建同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的DNA测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)裂解细胞以释放基因組DNA；2)使用由随机引物和特异性引物组成的混合引物对基因组DNA进行预扩增；和3)对预扩增之后的基因组DNA进行二次扩增，以获得所述DNA测序文库。本发明专利技术还涉及一种同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种用于构建同时实现基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的测序文库的方法和试剂盒
本专利技术涉及用于构建DNA测序文库的方法和试剂盒。更具体地，本专利技术涉及用于构建能同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的DNA测序文库的方法和试剂盒。
技术介绍
随着科技的进步，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对基因组测序，需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，高通量测序(也称第二代测序)技术应运而生。高通量测序技术的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq、NextSeq和LifeTechnologies/SOLIDsystem、PGM、Proton等。到目前为止，Hiseq2000每个run可以达到6个人基因组30x覆盖的测序通量，约600G/run数据，在测序时间上Hiseq2500可以达到平均每8分钟读取一个碱基的速度。而且随着第二代测序技术的成熟，将其应用于临床的研究迅猛发展。第二代测序技术在基因组拷贝数变异(CopyNumberVariation,CNV)、插入缺失标记(Insertion/Deletion，InDel)、单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)等检测领域的应用最为成熟。CNV是指与基因组参考序列相比，基因组中大于等于1kb的DNA片段插入、缺失、倒位、易位和/或重复，及其互相组合衍生出的复杂的染色体结构变异，其具有分布范围广、可遗传、相对稳定和高度异质性等特点。研究表明，CNV是肿瘤发生发展的重要因素，其可通过影响原癌和抑癌基因的活性而诱发肿瘤。InDel指的是在基因组的某个位置上所发生的小片段DNA序列的插入或者删除。Indel是人类基因组中除SNP外数量最多的变异形式，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域如启动子区和外显子区。据报道，InDel在基因表型相关的研究中具有广泛用途，并在植物分子育种以及人类疾病诊断方面发挥重要的作用。SNP是指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，包括但碱基的转换、颠换、缺失和插入等形式。SNP在人类基因组的平均密度较高，可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素，并且遗传稳定性较高，因此作为一类遗传标记得以广泛应用。例如，SNP可用于确定基因多态性与疾病的关系，解释个体间的表型差异对疾病的易感程度，预测和诊断疾病，研究不同基因型个体对药物反应的差异，从而指导药物开发以及临床合理用药等。然而，这三种变异类型，CNV、InDel和SNP对于测序的要求各不相同。具体而言，CNV一般为染色体水平的缺失或重复，因此CNV检测的关键是全基因组均匀覆盖，而对测序深度的要求不高(0.06x左右)。与此相反，对于InDel和SNP的检测，则要求目标区域达到一定的测序深度(至少20x)，而对基因组其他区域没有覆盖要求。在实践中，为了节约测序成本，一般根据不同变异类型对测序的要求而选用不同的检测策略。对于CNV检测，需采用全基因组DNA建库，低覆盖深度测序的方法来实现。而对于indel和SNP的检测，则需要对特异性扩增的目的片段进行建库，深度测序才能准确做出判断，从而达到检测目的。细胞是生物学的基本单位，通过对单个细胞进行基因组扩增和测序，可以解决用组织样本无法获得不同单个细胞的异质性信息、以及难以对罕见细胞进行常规测序的难题，从而为科学家研究单个细胞的行为、机制、与机体的关系等提供新方向，为早期检测、诊断疾病及疾病的个体化治疗提供指导。在实际应用中，往往需要在检测染色体水平的缺失或重复的同时检测单个基因是否发生SNP或InDel。对于一般样品来而言，这可以通过两次建库和上机来实现，缺点是操作繁琐，周期长，效率低。然而，对于某些细胞(例如罕见细胞)样本，由于样本量有限往往无法做到两次建库，因而无法检测全部三种变异。即使对罕见细胞样本进行全基因组深度测序，测序成本非常高的这一缺点也使其无法大规模应用。因此，迫切需要一种能快速同时实现单细胞基因组拷贝数异常检测和基因突变检测的方法。
技术实现思路
鉴于目前单细胞拷贝数变异与基因突变检测中所遇到的上述问题，本专利技术人发现了一种快速的、可同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的DNA测序文库的构建方法，其可适用于多种二代测序平台，包括但不限于如Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq、NextSeq和LifeTechnologies/SOLIDsystem、PGM、Proton等测序平台。本专利技术是基于专利技术人的以下发现：随机引物对全基因组的无差别扩增和特异性引物对目标区域的特异性扩增可以在相同反应条件下在同一体系中进行。通过选择合适的特异性引物，并且控制预扩增反应中特异性引物与随机引物的比例，可以在实现目标区域的特异性扩增量高于其他区域的同时，使得这种特异性扩增不会影响全基因组扩增的整体均匀性。依据本专利技术，低至单个细胞的样本起始量，可以构建出差异性富集的高质量DNA测序文库，从而实现在低样本起始量的情况下，同时检测基因组拷贝数变异和目标区域上的基因突变。因此，在第一个方面，本专利技术提供一种用于构建同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的DNA测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)裂解细胞以释放基因组DNA；2)使用由随机引物和特异性引物组成的混合引物对基因组DNA进行预扩增；3)对预扩增之后的基因组DNA进行二次扩增，以获得所述DNA测序文库。因此，根据本专利技术获得的DNA测序文库可以用于同时检测基因组拷贝数变异和基因突变(即，只需测序一次)，而避免两次构建文库以分别检测基因组拷贝数变异和基因突变的繁琐步骤。在第二个方面，本专利技术提供一种同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的方法，包括以下步骤：1)裂解细胞以释放基因组DNA；2)使用由随机引物和特异性引物组成的混合引物对基因组DNA进行预扩增；3)对预扩增之后的基因组DNA进行二次扩增，以获得所述DNA测序文库；和4)对所述DNA测序文库进行高通量测序以同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测。在第三个方面，本专利技术提供一种用于构建同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的DNA测序文库的试剂盒，包括：用于裂解细胞以释放基因组DNA的试剂、用于预扩增的由随机引物和特异性引物组成的混合引物、用于二次扩增的引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶。在一个实施方案中，用于构建本专利技术的测序文库的起始材料可以是单细胞或多细胞。例如，起始材料可以为胚胎8细胞期或囊胚期的活检细胞团。本专利技术中的“裂解细胞以释放基因组DNA”的步骤可以通过例如化学裂解、酶裂解、机械裂解等方法实现，从而释放其中的DNA。一般而言，化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，很少会使DNA断裂，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于构建同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的DNA测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)裂解细胞以释放基因组DNA；/n2)使用由随机引物和特异性引物组成的混合引物对基因组DNA进行预扩增；/n3)对预扩增之后的基因组DNA进行二次扩增，以获得所述DNA测序文库。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于构建同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的DNA测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)裂解细胞以释放基因组DNA；
2)使用由随机引物和特异性引物组成的混合引物对基因组DNA进行预扩增；
3)对预扩增之后的基因组DNA进行二次扩增，以获得所述DNA测序文库。


2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是8细胞期卵裂球的单细胞或囊胚期的活检细胞团。


3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述随机引物包含三部分结构：第一部分为通用区域，此区域在不同测序平台中序列不同；第二部分为简并碱基区域；第三部分为随机简并碱基区域。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述随机引物序列为：
5’GCTCTTCCGATCTRRRRRRRRRRN*N*N3’或
5’GCTCTTCCGATCTMMMMMMMMMMN*N*N3’或
5’GCTCTTCCGATCTYYYYYYYYYYN*N*N3’或
5’GCTCTTCCGATCTKKKKKKKKKKN*N*N3’，
其中R代表A或G碱基,M代表A或C碱基，Y代表C或T碱基，K代表G或T碱基，N代表随机简并碱基A/T/C/G，*代表硫代修饰。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性引物从5’端至3’端包含以下两部分结构：第一部分为通用区域，在不同测序平台中序列不同；第二部分是针对目标区域设计的特异性序列。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性引物在3’端包含硫代修饰。


7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述随机引物与特异性引物混合的摩尔比例为40:1-150:1，优选40:1-50:1。


8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二次扩增使用的引物从5’端开始包括两部分：第一部分为外延伸区，该区域含有可以和上机测序通用杂交引物相结合的区域；第二部分为引物匹配区，该区域含有可以和预扩增引物杂交的区域。...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾哲，陈迪，张建光，
申请(专利权)人：北京贝瑞和康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11