靶向基因组分析的方法技术

本发明专利技术提供了个体遗传分析的方法，其能够在单一测定中揭示靶标和特定基因组位点的基因序列和染色体拷贝数。本发明专利技术还提供了靶标基因序列和基因表达谱的灵敏和特异性检测的方法。

Methods of target genome analysis

【技术实现步骤摘要】
靶向基因组分析的方法相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年3月15日递交的美国临时申请第61/794,049号和2012年12月10日递交的美国临时申请第61/735,417号的权益，其通过引用整体并入本文中。关于序列表的申明与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质拷贝提供，并在此通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文档的名称为CLFK_001_02WO_ST25.txt。该文本文档为188KB，于2013年12月10日生成，并通过EFS-Web电子递交。专利技术背景
本专利技术总体上涉及个体遗传分析的方法，其能够在单一测定中揭示靶标和特定基因组位点的基因序列和染色体拷贝数。特别地，本专利技术涉及能够提供靶标基因序列或基因转录物的灵敏和特异性检测的方法，以及能够在单一测定中揭示变体序列和总基因拷贝数的方法。相关技术的描述单个人对象的完整人基因组序列和部分基因组再测序研究均揭示出，所有人似乎都具有不够完美的基因组这一基本理论。特别地，发现正常健康人对象在其基因组序列中具有数百(如果并非数千)的基因损伤。这些损伤中有许多已知或预期能够消除其所在的基因的功能。这意味着虽然正常的双倍体人具有大多数基因的两个功能拷贝，在所有人中仍然存在许多仅有一个(或零个)功能基因拷贝的情形。类似地，也会以较高频率遭遇到基因通过基因复制/扩增事件而被过度代表的情形。生物网络的一个关键特征是功能冗余。正常健康个体可耐受平均负荷的基因损伤，因为其平均具有每个基因的两个拷贝，使得丢失一个拷贝不重要。此外，基因组常常执行类似的功能，使得特定基因功能的较小扰动在功能元件的较大网络中通常得到补偿。虽然生物系统中功能补偿是总主题，仍然存在许多特定基因丢失可引起严重破坏性事件的情形。例如，癌症似乎是其中多个单独损伤的复合效应为不受控的细胞增殖的遗传性疾病的结果。类似地，处方药常常为通过非常特定的基因运送、代谢和/或清除的特定化学实体。这些基因的扰动虽然在正常情况下通常是不重要的，但在化疗期间可显现为不良事件(例如，副作用)。“个体化医疗”，越来越多地被称为“精密医疗”，其中心目标是将对患者具有特异性的遗传信息和与该个体的遗传谱相容的治疗选择融合起来。然而，个体化医疗的巨大潜力还有待实现。为了实现这一目标，必须有临床上可接受的强大遗传诊断测试，其能够可靠地确定相关基因的遗传状态。专利技术概述本文所包括的特定实施方案提供了产生经标记的DNA文库的方法，包括用末端修复酶处理片段化的DNA，从而产生片段化的经末端修复的DNA；以及将随机核酸标记序列和任选地样本编码序列和/或PCR引物序列与所述片段化的经末端修复的DNA连接，从而产生经标记的DNA文库。在特定的实施方案中，所述随机核酸标记序列为约2至约100个核苷酸。在一些实施方案中，本专利技术提供了约2至约8个核苷酸的随机核酸标记序列。在某些实施方案中，所述片段化的经末端修复的DNA包含平末端。在一些实施方案中，所述平末端经进一步修饰而包含单一碱基对悬垂部分。在某些实施方案中，所述连接包括将多功能适配子组件与所述片段化的经末端修复的DNA连接，从而产生所述经标记的DNA文库，其中所述多功能适配子分子包含：i)第一区，其包含随机核酸标记序列；ii)第二区，其包含样本编码序列；和iii)第三区，其包含PCR引物序列。在另外的实施方案中，所述方法还包括将经标记的DNA文库与至少一个多功能捕获探针组件杂交，从而形成复合物，其中所述多功能捕获探针组件与所述DNA文库中的特定靶标区杂交。在其他实施方案中，所述方法还包括分离所述经标记的DNA文库-多功能捕获探针组件复合物。在一些实施方案中，所述方法还包括用3′-5′核酸外切酶酶催化处理所述分离的经标记的DNA文库-多功能捕获探针组件复合物，从而去除单链3′端。在一些实施方案中，用于所述3′-5′核酸外切酶酶催化处理的酶为T4聚合酶。在特定的实施方案中，所述方法还包括利用所述分离的经标记的DNA文库片段作为模板，从所述多功能捕获探针的3’端进行5’-3’DNA聚合酶延伸所述分离的经标记的DNA文库-多功能捕获探针组件复合物。在某些实施方案中，所述方法还包括通过5’FLAP核酸内切酶、DNA聚合及通过DNA连接酶的切口封闭的协同作用，将所述多功能捕获探针与所述分离的经标记的DNA文库片段连接。在其他实施方案中，所述方法还包括对所述经3′-5′核酸外切酶酶催化处理的复合物进行PCR，其中所述多功能捕获探针分子的尾部被拷贝以产生杂交核酸分子，其中所述杂交核酸分子包含能够与所述多功能捕获探针组件杂交的基因组靶标区和所述多功能捕获探针组件尾部序列的互补序列。在不同的实施方案中，提供了靶向遗传分析的方法，包括：a)将经标记的DNA文库与多功能捕获探针组件复合物杂交，其中所述多功能捕获探针组件选择性地与所述DNA文库中的特定靶标区杂交；b)分离来自a)的经标记的DNA文库-多功能捕获探针组件复合物；c)使用具有3′-5′核酸外切酶活性的酶，对来自b)的分离的经标记的DNA文库-多功能捕获探针组件复合物进行3′-5′核酸外切酶酶催化处理，从而去除单链3′端；d)对来自c)的经酶催化处理的复合物进行PCR，其中所述多功能捕获探针分子的尾部被拷贝以产生杂交核酸分子，其中所述杂交核酸分子包含能够与所述多功能捕获探针组件杂交的靶标区和所述多功能捕获探针组件尾部序列的互补序列；以及e)对来自d)的杂交核酸分子进行靶向遗传分析。在不同的特定实施方案中，提供了靶向遗传分析的方法，包括：a)将经标记的DNA文库与多功能捕获探针组件复合物杂交，其中所述多功能捕获探针组件选择性地与所述DNA文库中的特定靶标区杂交；b)分离来自a)的经标记的基因组文库-多功能捕获探针组件复合物；c)利用所述分离的经标记的DNA文库片段作为模板，进行多功能捕获探针的5′-3′DNA聚合酶延伸；d)对来自c)的经酶催化处理的复合物进行PCR，其中所述分离的靶标区的互补序列被拷贝以产生杂交核酸分子，其中所述杂交核酸分子包含所述DNA靶标区的互补序列、所述多功能捕获探针的靶标特异性区域和所述多功能捕获探针组件尾部序列；以及e)对来自d)的杂交核酸分子进行靶向遗传分析。在不同的某些实施方案中，提供了靶向遗传分析的方法，包括：a)将经标记的DNA文库与多功能捕获探针组件复合物杂交，其中所述多功能捕获探针组件选择性地与所述DNA文库中的特定靶标区杂交；b)分离来自a)的经标记的DNA文库-多功能捕获探针组件复合物；c)通过5’FLAP核酸内切酶、DNA聚合和通过DNA连接酶的切口封闭的协同作用，进行杂交多功能捕获探针-分离的经标记的DNA靶标分子的产生；d)对来自c)的酶催化处理的复合物进行PCR，其中将所述多功能捕获探针分子与所述分离的经标记的DNA靶标克隆连接，以产生杂交核酸分子，其中所述杂交核酸分子包含能够与所述多功能捕获探针组件杂交的基因组靶标区和所述多功能捕获探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.产生经标记的基因组文库的方法，包括：/n(a)用末端修复酶处理片段化的基因组DNA，从而产生片段化的经末端修复的基因组DNA；和/n(b)将随机核酸标记序列以及任选地样本编码序列和/或PCR引物序列与所述片段化的经末端修复的基因组DNA连接，从而产生所述经标记的基因组文库。/n

【技术特征摘要】
20121210 US 61/735,417;20130315 US 61/794,0491.产生经标记的基因组文库的方法，包括：
(a)用末端修复酶处理片段化的基因组DNA，从而产生片段化的经末端修复的基因组DNA；和
(b)将随机核酸标记序列以及任选地样本编码序列和/或PCR引物序列与所述片段化的经末端修复的基因组DNA连接，从而产生所述经标记的基因组文库。


2.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述随机核酸标记序列为约2至约100个核苷酸。


3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述随机核酸标记序列为约2至约6个核苷酸。


4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述片段化的经末端修复的基因组DNA包含平末端。


5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述平末端被进一步修饰而包含单碱基对悬垂部分。


6....

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯多弗·K·雷蒙德，克里斯多弗·D·阿莫尔，林继力，
申请(专利权)人：分析生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US