一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种(2S,3S)‑2‑羟基‑4‑苯基丁烷衍生物的制备方法，将(3S)‑3‑(叔丁氧羰基)氨基‑1‑氯‑4‑苯基‑2‑丁酮、羰基还原酶和过量的异丙醇进行生物酶催化反应获得转化液，再经连续浓缩结晶获得目标产物结晶；该羰基还原酶通过定向突变具有高浓度异丙醇耐受的特点，从而实现过量异丙醇对底物增溶，进而增加底物投量，提高了转化率，产品收率不低于95%，手性纯度不低于99.95%。本发明专利技术对转化液通过连续浓缩结晶，获得的产物结晶度95%以上，晶体均一，杂质纯度不低于99.95%，含量不低于99%。

【技术实现步骤摘要】
一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法
本专利技术涉及生物酶催化工艺领域，具体地说涉及一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法。
技术介绍
非肽类HIV蛋白酶抑制剂（PI），是治疗HIV首选药物，如沙奎那韦、奈非那韦、福沙那韦、地瑞那韦等，例如地瑞那韦可通过阻断从受感染的宿主细胞表面释放新的、成熟的病毒粒子的形成过程，抑制病毒的蛋白酶而起作用，2006年6月，FDA批准地瑞那韦与其他抗逆转录病毒药物联合用于治疗HIV感染的成年患者，2007年3月地瑞那韦在欧盟的27个成员国上市。上述化合物的核心结构都为(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物结构。例如地瑞那韦主要通过式III化合物（化学名称：(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷）为中间体制备得到，该分子结构复杂，化学合成污染严重且难度较高。该结构存在两个手性中心，其中一个手性中心来源于天然的苯丙氨酸，另一个手性中心可将前手性的酮还原成手性醇，从而引入BOC-环氧化物上的第二个手性中心。若引入的第二个手性中心为R构型，则产物为(2R,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷，该构型为RS型，是合成阿扎那韦重要中间体；若引入的第二个手性中心为S构型，则产物为式III化合物，该构型为SS型。目前(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷主要通过化学反应制备得到。欧洲专利EP1081133B1（优先权日1999年8月31日）公开了以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为原料，采用三叔丁氧基氢化铝锂或二异丁基氢铝等铝盐还原，收率为92%。上述化学合成方法均存在污染严重、溶剂回收困难、反应条件苛刻等问题。生物催化法合成具有反应操作简单、成本低、条件温和、能耗小、环境友好和产品光学纯度高等优势，因此受到越来越多的关注，羰基还原酶类(EC1.1.1.184)的某些酶可用于立体选择性转化前立体异构的醛或酮底物为对应的手性醇产物，还可以催化逆反应，即醇底物被氧化为相应的酮/醛产物。因此合理利用生物催化方法，可将式IV化合物还原为式III化合物，进而用于后续的药物合成。生物酶催化反应对酮和醛的还原以及醇的氧化需要辅因子，其中最常见的为NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）以及用于氧化反应的NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和NADP+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。NADH和NADPH充当电子供体，而NAD+和NADP+充当电子受体。由于辅因子成本较高，通常可选用葡萄糖或异丙醇作为电子供体驱使辅因子循环，而葡萄糖或异丙醇被氧化为相应的葡萄糖酸或丙酮，而酮底物一般被还原为相应的目的醇产物。中国专利CN102482648B公开了选用来源于Novosphingobiumaromaticivorans羰基还原酶基因构建工程菌催化(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，底物浓度100g/L，收率大于95%，产物非对映体过量de大于99.9%，但该专利只提供了制备RS构型的技术，而非SS构型。对于SS构型的生物制备，中国专利CN104745649A公开了采用(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，底物投加浓度为50g/L，通过助溶剂和表面活性剂助溶，促进转换体系流动性，增加底物与酶接触面积，若不加助溶剂，转化体系流动性变差，进而影响转化率。但该专利为了助溶，体系内容额外添加的甲苯、吐温60等物质不利于产品最后分离提纯，因此产品纯度只有99%。中国专利CN104745649A同样公开了SS构型的生物酶制备方法，但该方法的转化体系选用葡萄糖作为供氢体系，底物浓度100g/L，反应体系几乎全为水相，由于底物及SS构型产物均难溶于水，随着投加底物浓度的提高，且不加助溶剂，体系流动性会逐渐变差，转化率逐渐下降，进而限制底物浓度投加量，且反应结束体系中含有副产物葡萄酸盐，给产物分离纯化带来困难，难以用于工业化生产。综上，目前本领域以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物通过生物酶催化技术制备(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物，底物浓度投加量因溶解性问题一般无法超过100g/L，或需要额外增加助溶剂使体系带入其他杂质，进而影响SS构型产物分离纯化及纯度，复杂的生产工艺也提高了生产成本。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种利用特定羰基还原酶生物催化制备(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物并进一步浓缩结晶的方法。技术方案：一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，将底物、羰基还原酶和过量的有机溶剂在含有再生供氢辅因子的缓冲液中进行生物酶催化反应获得转化液，再经连续浓缩结晶获得目标产物结晶；所述底物为式（I）所示化合物，所述目标产物为式（II）所示化合物，其中，式（I）和式（II）中的R为相同的氨基保护基团；其中，所述羰基还原酶与SEQIDNo.1所示氨基酸序列的同源性不低于95%；所述有机溶剂在反应体系的浓度为15-60%(m/V)。本专利技术的羰基还原酶是通过对CX-LACII菌株的基因进行定点突变获得的。经定点突变，该酶不仅具有优秀的羰基还原特性，还具有高浓度有机溶剂耐受的效果。利用相应的酶液进行生物催化反应，可将底物和原料浓度提升至超过现有技术的上限，进而显著提高了转化率。CX-LACII菌株于2020年2月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CGMCC)，保藏编号NO.19432，经鉴定为谷糠乳杆菌（Lactobacillusfarraginis），兼性厌氧，在MRS固体培养基，菌落凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落呈圆形，直径为3.0 mm±1.0 mm。 显微镜下，革兰氏染色阳性，一般呈短杆状，排成链，通常不运动。CX-LACII含有基因序列如SEQIDNo.3所示。所述的定点突变包括对CX-LACII氨基酸序列第8位、第173位、第190位、第226位的氨基酸进行定向突变。具体地说，是将第8位的K突变为N，第173位的D突变为E，第190位的Y突变为P，第226位的I突变为N。所述羰基还原酶氨基酸序列与目前已知的乳杆菌属羰基还原酶（Lactobacillussp.）的同源性在80%左右。定点突变时保留辅酶结合域保守序列GATLGIG（CXPII氨基酸序列第14-20位）及催化保守序列YNASK（CXPII氨基酸序列第156-160位）。同时，需保留190-220位氨基酸残基，该区域在蛋白结构中形成环状结构，可用于与底物结合环。除此之外，对其他非关键位点进行突变获得的羰基还原酶，在与SEQIDNo.1所示氨基酸序列同源性不低于99%的情况下，都具备显著的酶催化效率和高浓度有机溶剂耐受的特性。本专利技术的目标产物化合物（II）是式（I）底物被上述羰基还原酶转化获得的。式（V）进一步展示了底物在羰基还原酶和N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：将底物、羰基还原酶和过量的有机溶剂在含有再生供氢辅因子的缓冲液中进行生物酶催化反应获得转化液，再经连续浓缩结晶获得目标产物结晶；/n所述底物为式（I）所示化合物，所述目标产物为式（II）所示化合物，其中，式（I）和式（II）中的R为相同的氨基保护基团；/n

【技术特征摘要】
1.一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：将底物、羰基还原酶和过量的有机溶剂在含有再生供氢辅因子的缓冲液中进行生物酶催化反应获得转化液，再经连续浓缩结晶获得目标产物结晶；
所述底物为式（I）所示化合物，所述目标产物为式（II）所示化合物，其中，式（I）和式（II）中的R为相同的氨基保护基团；



其中，所述羰基还原酶与SEQIDNo.1所示氨基酸序列的同源性不低于95%；所述有机溶剂在反应体系的浓度为15-60%(m/V)。


2.根据权利要求1所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述羰基还原酶来源于谷糠乳杆菌（Lactobacillusfarraginis），且与SEQIDNo.1所示氨基酸序列的同源性不低于99%。


3.根据权利要求1或2所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为异丙醇、乙醇、正丁醇的任意一种或多种的组合。


4.根据权利要求3所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂在反应体系的浓度为20-50%(m/V)，所述底物的投料浓度为100~400g/L，生物催化反应24小时的转化率不低于95.0%，所述目标产物的de值不低于99.5%。


5.根据权利要求4所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述羰基还原酶与底物的质量比为0.03~0.1:1，所述羰基还原酶催化反应的温度为35-45℃，缓冲液的pH为7~9。


6.根据权利要求5所述的一种(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为异丙醇，底物的投料浓度为80~200g/L，生物催化反应2...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨卫华，谈聪，张利坤，钱敏帆，金力，倪建洲，葛文强，
申请(专利权)人：长兴制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33