基于DMRTA2和FOXD3基因的肺癌诊断试剂及试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及DMRTA2和FOXD3基因联合检测肺癌，以及肺癌检测/诊断试剂和试剂盒，所述的试剂或试剂盒包括针对DMRTA2和FOXD3基因甲基化的检测试剂，用于检测DMRTA2和FOXD3基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列。本发明专利技术的试剂经试验证实，可以高灵敏、高特异地检测和诊断肺癌，有极高的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
基于DMRTA2和FOXD3基因的肺癌诊断试剂及试剂盒
本专利技术属于基因诊断领域，具体地，本专利技术涉及一种DMRTA2和FOXD3基因在肺癌检测中的应用，以及含有DMRTA2和FOXD3基因的甲基化检测/诊断试剂，以及含有该试剂的试剂盒。
技术介绍
肺癌是起源于支气管粘膜、腺体或肺泡上皮的肺部恶性肿瘤。按照病理类型可以分为：1)小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)：一种特殊病理学类型的肺癌，有明显的远处转移倾向，预后较差，但多数病人对放化疗敏感；2)非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)：除小细胞肺癌以外其他病理学类型的肺癌，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。在生物学行为和临床病程方面具有一定差异。按照发生位置又可以分为：1)中心型肺癌(centrallungcancer)：生长在肺段支气管开口及以上的肺癌：2)周围型肺癌(peripherallungcancer)：生长在肺段支气管开口以远的肺癌。近年来，人口老龄化、大气污染及吸烟等因素的影响，致使中国肺癌的发病率和死亡率逐年递增，根据国家癌症中心发布的《2017中国肿瘤登记年报》显示，全国每分钟约7人确诊患癌，其中肺癌发病率与死亡率均为第一位。中国已成为世界上肺癌人数最多的国家，专家预测到2025年中国肺癌的人数将达到100万。而根据流行病学研究显示：吸烟是引起肺癌的重要因素。世界上约80％-90％的肺癌可归因于吸烟。与非吸烟者相比，45-64岁每日吸香烟1-19支和20支以上者患肺癌的相对危险度分别为4.27和8.61，与从不吸烟者比较，长期每日吸烟1-19支和20支以上者死于肺癌的相对危险度分别为6.14和10.73。虽然肺癌的治疗技术日新月异，但5年生存率从4％仅上升至12％左右，现有的抗肿瘤药物仍只能起到缓解病情作用，患者无进展生存期平均仅延长3个月～5个月，但对于Ⅰ期肺癌患者，手术后5年生存率高达约60％～70％。因此肺癌的早期诊断与早期手术是提高肺癌5年生存率、降低死亡率最有效的方法之一。肺癌目前的临床辅助诊断主要有以下几种，但是他们都不能完全做到早发现，早诊断：(1)血液生化检查：对于原发性肺癌，目前无特异性血液生化检查。肺癌病人血液碱性磷酸酶或血钙升高考虑骨转移的可能，血液碱性磷酸酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶或胆红素升高考虑肝转移的可能。(2)肿瘤标志物检查：1)CEA：30％～70％肺癌患者血清中有异常高水平的CEA，但主要见于较晚期肺癌患者。目前血清中CEA的检查主要用于估计肺癌预后以及对治疗过程的监控。2)NSE：是小细胞肺癌首选标志物，用于小细胞肺癌的诊断和监测治疗反应，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。3)CYFRA21-1：是非小细胞肺癌的首选标记物，对肺鳞癌诊断的敏感性可达60％，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。目前，目前用于肺癌检测的标志物的敏感性、特异性以及应用范围还有待提高。(3)影像学检查：1)胸部X线检查：应包括胸部正位和侧位片。在基层医院，胸部正侧位片仍是肺癌初诊时最基本和首选的影像诊断方法。一旦诊断或疑诊肺癌，即行胸部CT检查。2)CT检查：胸部CT是肺癌的最常用和最重要的检查方法，用于肺癌的诊断与鉴别诊断、分期及治疗后随诊。CT引导下肺穿刺活检是肺癌的重要诊断技术，有条件的医院可将其用于难以定性的肺内病变的诊断，以及临床诊断肺癌需经细胞学、组织学证实而其它方法又难以取材的病例。近年来，多层螺旋CT和低剂量CT(LDCT)是发现早期肺癌和降低死亡率的有效筛查工具，全美国家肺癌筛查研究(NLST)已经表明LDCT相比胸部X线筛查可降低20％肺癌的死亡率。低剂量螺旋CT被推荐为早期肺癌筛查的重要手段，但是人为影响因素较多，假阳性率非常高。3)超声检查：主要用于发现腹部重要器官及腹腔、腹膜后淋巴结有无转移，也用于颈部淋巴结的检查。对于贴邻胸壁的肺内病变或胸壁病变，可鉴别其囊实性及进行超声引导下穿刺活检；超声还常用于胸水抽取定位。4)骨扫描：对肺癌骨转移检出的敏感性较高，但有一定的假阳性率。可用于以下情况：肺癌的术前检查；伴有局部症状的病人。(4)其它检查：1)痰细胞学检查：目前肺癌简单方便的无创诊断方法，连续涂片检查可提高阳性率约达60％，是可疑肺癌病例的常规诊断方法。2)纤维支气管镜检查：肺癌诊断中最重要的手段之一，对于肺癌的定性定位诊断和手术方案的选择有重要的作用。对拟行手术治疗的患者为必需的常规检查项目。而经支气管镜穿刺活检检查(TBNA)，虽利于治疗前分期，但因技术难度和风险较大，有需要者应转上级医院进一步检查。3)其他：如经皮肺穿刺活检、胸腔镜活检、纵隔镜活检、胸水细胞学检查等，在有适应症的情况下，可根据现有条件分别采用以协助诊断。早期肺癌患者往往无明显的症状和体征，很容易被患者忽视，很少因症就诊。临床常规的胸片X光和痰脱落细胞学检查远远达不到筛查早期肺癌的要求，均未被证实能降低死亡率。胸部X线的筛查漏检率可高达54％-90％，痰脱落细胞学检查虽然成本低，不需要昂贵设备，但是漏检率高，结果判断的人为因素干扰较多，而且需要多次送检。低剂量螺旋CT被推荐为早期肺癌筛查的重要手段，但是人为影响因素较多，假阳性率非常高。在临床实践工作中证明，任何肺癌筛查项目的成败取决于高危人群的识别，融合多重高危因素的风险预测模型已被世界公认是识别肺癌高危人群的方法之一。随着技术的飞速发展，肿瘤标志物检测成为继影像学诊断，病理诊断之后的肿瘤诊断治疗新领域，能够对肿瘤的诊断，检测，治疗产生重大的影响。肿瘤标志物可以在体液或者是组织中检测到，能够反映肿瘤的存在，分化程度，预后估计和个性化用药以及治疗效果等。早期肺癌患者没有明显的症状，难以被医生和患者察觉，再加之其在血液或生化项目上没有明显的特异性的标识物，因此难以通过常规的诊断方法进行早期发现和早期诊断，因此对肺癌早期诊断，尤其是大规模应用人群筛查上较为困难。越来越多的研究表明，在肿瘤形成过程中包含两大类机制。一个是通过DNA核苷酸序列改变而形成突变，即遗传学机制。肿瘤作为一种遗传学疾病在分子生物学领域已经得到证实。另外一个就是表观遗传学(epigenetics)机制，即不依赖DNA序列改变导致基因表达水平的变化，它在肿瘤形成过程中的作用越来越受到重视。遗传学与表观遗传学两种机制相互交叉存在，共同促进了肿瘤的形成。基因的异常甲基化在肿瘤发生的早期就可出现，并且在肿瘤逐步发展的过程中，基因异常甲基化的程度增加。对常见的98种人类原发肿瘤的基因组进行分析，发现每种肿瘤至少有600个异常甲基化的CpG岛。许多研究显示启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件，因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标，被认为是一种有前景的肿瘤分子生物标志物(biomarker)。更为重要的是，癌变细胞可以释放DNA到外周血中。正常人外周血中都存在纳克级的游离DNA。研究发现外周血血浆/血清、肿瘤累及器官相关的体液(如唾液、痰等)中同样可以检测到肿瘤组织中存在的肿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.DMRTA2基因或其核酸片段，以及FOXD3基因或其核酸片段在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.DMRTA2基因或其核酸片段，以及FOXD3基因或其核酸片段在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的DMRTA2基因的核酸片段选自SEQIDNO：22、SEQIDNO：24、SEQIDNO：26或SEQIDNO：28，FOXD3基因的核酸片段选自SEQIDNO：30、SEQIDNO：32、或SEQIDNO：34；优选地，所述的DMRTA2基因的核酸片段选自SEQIDNO：22，所述的FOXD3基因的核酸片段选自SEQIDNO：30。


3.一种引物组合，其特征在于，所述的引物组合含有引物对A和引物对B；
所述引物对A选自以下的任意一对：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：38和SEQIDNO：39，SEQIDNO：41和SEQIDNO：42，SEQIDNO：44和SEQIDNO：45，SEQIDNO：47和SEQIDNO：48，SEQIDNO：50和SEQIDNO：51，SEQIDNO：53和SEQIDNO：54，SEQIDNO：56和SEQIDNO：57，SEQIDNO：59和SEQIDNO：60，SEQIDNO：62和SEQIDNO：63，SEQIDNO：65和SEQIDNO：66，SEQIDNO：68和SEQIDNO：69，SEQIDNO：71和SEQIDNO：72，SEQIDNO：74和SEQIDNO：75，SEQIDNO：77和SEQIDNO：78；
所述引物对B选自以下的任意一对：
SEQIDNO：80和SEQIDNO：81，SEQIDNO：83和SEQIDNO：84，SEQIDNO：86和SEQIDNO：87，SEQIDNO：89和SEQIDNO：90，SEQIDNO：92和SEQIDNO：93，SEQIDNO：95和SEQIDNO：96，SEQIDNO：98和SEQIDNO：99，SEQIDNO：101和SEQIDNO：102，SEQIDNO：104和SEQIDNO：105，SEQIDNO：107和SEQIDNO：108，SEQIDNO：110和SEQIDNO：111，SEQIDNO：113和SEQIDNO：114，SEQIDNO：116和SEQIDNO：117，SEQIDNO：119和SEQIDNO：120；
优选地，所述的引物对A选自以下的任意一对：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：38和SEQIDNO：39，SEQIDNO：41和SEQIDNO：42，SEQIDNO：44和SEQIDNO：45，SEQIDNO：47和SEQIDNO：48，SEQIDNO：62和SEQIDNO：63，SEQIDNO：71和SEQIDNO：72；
所述的引物对B选自以下的任意一对：
SEQIDNO：80和SEQIDNO：81，SEQIDNO：83和SEQIDNO：84，SEQIDNO：86和SEQIDNO：87，SEQIDNO：89和SEQIDNO：90，SEQIDNO：92和SEQIDNO：93，SEQIDNO：107和SEQIDNO：108；
更优选地，所述的引物对A选自以下的任意一对：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：38和SEQIDNO：39，SEQIDNO：41和SEQIDNO：42，SEQIDNO：44和SEQIDNO：45，SEQIDNO：47和SEQIDNO：48；
所述的引物对B选自以下的任意一对：
SEQIDNO：80和SEQIDNO：81，SEQIDNO：83和SEQIDNO：84，SEQIDNO：86和SEQIDNO：87，SEQIDNO：89和SEQIDNO：90，SEQIDNO：92和SEQIDNO：93；
最优选地，所述的引物对A选自：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，所述的引物对B选自：SEQIDNO：80和SEQIDNO：81。


4.一种核酸探针组合，其特征在于，所述的探针组合含有探针C和探针D；
所述探针C选自以下任一序列：
SEQIDNO：3，SEQIDNO：40，SEQIDNO：43，SEQIDNO：46，SEQIDNO：49，SEQIDNO：52，SEQIDNO：55，SEQIDNO：58，SEQIDNO：61，SEQIDNO：64，SEQIDNO：67，SEQIDNO：70，SEQIDNO：73，SEQIDNO：76，SEQIDNO：79；
所述探针D选自以下任一序列：
SEQIDNO：82，SEQIDNO：85，SEQIDNO：88，SEQIDNO：91，SEQIDNO：94，SEQIDNO：97，SEQIDNO：100，SEQIDNO：103，SEQIDNO：106，SEQIDNO：109，SEQIDNO：112，SEQIDNO：115，SEQIDNO：118，SEQIDNO：121；
优选地，所述探针C选自以下任一序列：
SEQIDNO：3，SEQIDNO：40，SEQIDNO：43，SEQIDNO：46，SEQIDNO：49，SEQIDNO：64，SEQIDNO：73；
所述探针D选自以下任一序列：
SEQIDNO：82，SEQIDNO：85，SEQIDNO：88，SEQIDNO：91，SEQIDNO：94，SEQIDNO：109；
更优选地，所述探针C选自以下任一序列：
SEQIDNO：3，SEQIDNO：40，SEQIDNO：43，SEQIDNO：46，SEQIDNO：49；
所述探针D选自以下任一序列：
SEQIDNO：82，SEQIDNO：85，SEQIDNO：88，SEQIDNO：91，SEQIDNO：94；
最优选地，所述探针C选自SEQIDNO：3，所述探针D选自SEQIDNO：82。


5.权利要求3或4所述的引物或核酸探针在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。


6.一种肿瘤检测/诊断试剂，其特征在于，所述的试剂含有DMRTA2基因和FOXD3基因甲基化的检测试剂。


7.根据权利要求6所述的检测/诊断试剂，其特征在于，所述的DMRTA2基因和FOXD3基因甲基化的检测试剂是分别检测DMRTA2基因和FOXD3基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列；
优选地，经亚硫酸氢盐修饰。


8.根据权利要求6所述的检测/诊断试剂，其特征在于，所述试剂针对DMRTA2基因的检测区域如SEQIDNO：22、SEQIDNO：24、SEQIDNO：26或SEQIDNO：28所示：22；优选地，如SEQIDNO：22所示；
所述试剂针对FOXD3基因的检测区域如SEQIDNO：30、SEQIDNO：32、或SEQIDNO：34所示；优选地，如SEQIDNO：30所示。


9.根据权利要求6所述的检测/诊断试剂，其特征在于，所述试剂含有检测DMRTA2基因和FOXD3基因的引物；
优选地，检测DMRTA2基因的引物选自SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：38和SEQIDNO：39，SEQIDNO：41和SEQIDNO：42，SEQIDNO：44和SEQIDNO：45，SEQIDNO：47和SEQIDNO：48，SEQIDNO：50和SEQIDNO：51，SEQIDNO：53和SEQIDNO：54，SEQIDNO：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵荣淞，李仕良，牛智通，黄龙武，吴幽治，邱浩纯，邹鸿志，
申请(专利权)人：广州市康立明生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东;44