检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒。本发明专利技术首先提供了一种用于检测人EGFR基因18‑21外显子多个突变位点的检测剂组合物，其包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。本发明专利技术还提供了相关检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术可同时检测EGFR基因51种突变，每种突变的检出率基本一致，检测灵敏度可达0.1％，同时适用于cfDNA和组织DNA中的突变检测。

【技术实现步骤摘要】
检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒
本专利技术是关于一种同时检测人EGFR基因18-21号外显子上51种突变的引物、探针、多重qPCR反应体系及试剂盒，属于生物
和医学领域。
技术介绍
EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四个分子构成，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号传导通路有关。EGFR信号传导的异常是多种肿瘤发生的原因。EGFR突变主要发生在胞内酪氨酸激酶(TK)区域的前四个外显子上(18～21)。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是delE746-A750，替代突变最常见的是发生在外显子21上的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。其中外显子20上的T790M替代突变为一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TyrosineKinaseInhibitor，TKI)的耐药突变。此外，还有许多类型的突变临床意义尚不明确。EGFR作为癌症治疗的分子靶标受到普遍关注，并已陆续开发出了吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)和埃克替尼(Icotinib)等TKI。目前肿瘤组织样本仍是获取肿瘤基因相关信息的主要来源，但大部分晚期肺癌患者已失去手术机会或由于种种原因不能获取肿瘤组织样本。研究结果表明，实体肿瘤患者的外周血中存在来源于凋亡、坏死的肿瘤细胞的游离DNA。对晚期肺癌患者，在不能获取肺癌组织样本时，可以选择外周血样本进行EGFR突变基因检测。因此血浆样本中EGFR突变也可以预测患者服用TKI的治疗效果。常用的基因突变检测方法有两种：测序法和PCR法。测序法中包含直接测序法和二代测序(NGS)。直接测序法是金标准，可以检测已知突变和未知突变，缺点是灵敏度低，需要丰度达到20％，耗时长，假阴性高。NGS二代测序能同时检测多种基因突变，灵敏度达到5％，但是成本较高，耗时也长。患者一般需等待一周才能拿到检测报告。PCR法中包括高分辨率溶解曲线法(high-resolutionmelting，HRM)、扩增阻滞突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)和数字PCR法等。高分辨率熔解曲线是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，可以检测出单个碱基的差异，但检测敏感度约5％，只能检测已知突变，不适合做多重PCR。扩增阻滞突变系统是一种基于PCR法检测DNA点突变的新方法，其原理是：在严格反应条件下，只有引物3’端与模板配对时，PCR扩增反应才能正常进行，从而得到扩增产物。当3’端与模板不匹配时，TaqDNA聚合酶缺少3’-5’的外切酶活性，因此无法切下不匹配的碱基，导致3’末端无法正常延伸，反应终止，得不到扩增产物。通过设计3’端与突变模板互补但是与野生型模板不互补的引物进行PCR反应，根据有无特异长度的产物来判断样品模板中是否存在突变。该方法的灵敏度能达到1％，目前广泛应用于肿瘤组织中的突变检测。数字PCR法是一种核酸分子绝对定量技术，可直接测出模板的拷贝数。利用数字PCR结合ARMS引物或MGB探针可将检测灵敏度提升至0.01％。然而目前数字PCR仪只能同时检测两通道的信号，无法实现更多重的PCR检测，通量低，检测过程繁琐，耗时长，成本高。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种针对EGFR基因多种突变的检测剂组合物及试剂盒，提高检测灵敏度，供临床医生在非小细胞肺癌患者中筛选适合服用抗EGFR的靶向治疗药物的人群。由于血液样本中的游离DNA含量非常低，其中肿瘤DNA的含量更低，一般不超过1％，为了能在有限的血液样本量中检测更多的突变位点，一方面，本专利技术提高了一种用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物，该组合物包括：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10和SEQIDNo.11。所述SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10和SEQIDNo.11是用于检测19del突变的引物，具体序列如下：E-19-F1：5'-TAAAATTCCCGTCGCTATCAAAA-3'(SEQIDNo.1)；E-19-F2：5'-TAAAACTCCCGTCGCTATCGC-3'(SEQIDNo.2)；E-19-F3：5'-ATTCCCGTCGCTATCAAGTCTC-3'(SEQIDNo.3)；E-19-F4：5'-CCGTCGCTATCAAGGCATCT-3'(SEQIDNo.4)；E-19-F5：5'-CCCGTCGCTATCAAGGAACC-3'(SEQIDNo.5)；E-19-F6：5'-CCCGTCGCTATCAAGGAACA-3'(SEQIDNo.6)；E-19-F7：5'-CTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACCC-3'(SEQIDNo.7)；E-19-F8：5'-TTCCCGTCGCTATCAAGGT-3'(SEQIDNo.8)；E-19-F9：5'-CGTCGCTATCAAGGAAGC-3'(SEQIDNo.9)；E-19-F10：5'-CCCGTCGCTATCAAAGC-3'(SEQIDNo.10)；E-19-R：5'-GCCTGAGGTTCAGAGCCAT-3'(SEQIDNo.11)。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物还可包括以下引物：SEQIDNo.14和SEQIDNo.15；和/或SEQIDNo.18和SEQIDNo.19。引物SEQIDNo.14和SEQIDNo.15是用于检测L858R突变，具体序列如下：E-21-F1：5'-ATGTCAAGATCACAGATTTTGGTCG-3'(SEQIDNo.14)；E-21-R1：5'-CCTTACTTTGCCTCCTTCTGC-3'(SEQIDNo.15)。引物SEQIDNo.18和SEQIDNo.19是用于检测T790M突变，具体序列如下：E-20-F1：5'-CTCCACCGTGCAGCTCATCTT-3'(SEQIDNo.18)；E-20-R1：5'-GCCAATATTGTCTTTGTGTTCCC-3'(SEQIDNo.19)。根据本专利技术的具体实施方案，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物，该组合物包括：/n用于检测19del突变的引物：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQID No.11。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物，该组合物包括：
用于检测19del突变的引物：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10和SEQIDNo.11。


2.根据权利要求1所述的检测剂组合物，该组合物还包括以下引物：
用于检测L858R突变的引物：SEQIDNo.14和SEQIDNo.15；和/或
用于检测T790M突变的引物：SEQIDNo.18和SEQIDNo.19。


3.根据权利要求1或2所述的检测剂组合物，该组合物还包括以下引物：
用于检测G719X突变的引物：SEQIDNo.22、SEQIDNo.23、SEQIDNo.24和SEQIDNo.25；和/或
用于检测L861Q突变的引物：SEQIDNo.28和SEQIDNo.15；和/或
用于检测S768I突变的引物：SEQIDNo.30和SEQIDNo.31。


4.根据权利要求1或2或3所述的检测剂组合物，该组合物还包括以下引物：
用于检测20ins突变的引物：SEQIDNo.34、SEQIDNo.35、SEQIDNo.36、SEQIDNo.38和SEQIDNo.39。


5.根据权利要求1～4任一项所述的检测剂组合物，该组合物还包括用于检测19del、L858R、T790M、G719X、L861Q、S768I和/或20ins的探针，所述探针的荧光基团选用FAM、VIC、ROX和/或CY5，淬灭基团选用BHQ和/或MGB；
优选地，针对一个反应孔同时使用四种不同荧光基团标记的探针；进一步优选的探针的标记组合为5’FAM-3’MGB、5’VIC-3’BHQ1、5’ROX-3’MGB和5’CY5-3’BHQ3；
更进一步优选地，所述探针选自：SEQIDNo.12、SEQIDNo.16、SEQIDNo.20、SEQIDNo.26、SEQIDNo.32和SEQIDNo.39。


6.根据权利要求1～5任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：林张军，曹飞，杨卫平，
申请(专利权)人：河南爱微迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41