双特异性抗体及其用途制造技术

本公开涉及双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段以不同的结合亲和力特异性结合两种不同抗原。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双特异性抗体及其用途优先权要求本申请要求2017年8月1日提交的美国临时申请序列号No.62/539,970和2018年4月6日提交的美国临时申请序列号62/654,112的权益。前述的全部内容通过引用并入本文。
本公开涉及双特异性抗体或其抗原结合片段。
技术介绍
双特异性抗体是可以同时结合两种不同类型的抗原或两种不同表位的人工蛋白质。这种双重特异性打开了广泛的应用领域，包括将T细胞重定向至肿瘤细胞，同时阻断两个不同的信号传导途径，双重靶向不同的疾病介体以及将药物(payload)递送至靶向部位。卡妥索单抗(catumaxomab)(抗EpCAM和抗CD3)和博纳吐单抗(blinatumomab)(抗CD19和抗CD3)的批准已成为开发双特异性抗体的重要里程碑。由于双特异性抗体具有各种应用，因此需要继续开发基于双特异性抗体的各种治疗剂。
技术实现思路
本公开涉及不平衡的双特异性抗体或抗原结合片段，其中双特异性抗体或抗原结合片段以不同的结合亲和力特异性结合两种不同抗原。在一些方面，本公开涉及一种双特异性抗体或抗原结合片段，包括：第一重链可变区、第二重链可变区、第一轻链可变区、和第二轻链可变区，其中，所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区彼此缔合，形成第一抗原结合区，所述第一抗原结合区以大于107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、或1012M-1的结合亲和力特异性结合第一抗原，并且所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区彼此缔合，形成第二抗原结合区，所述第二抗原结合区以小于109M-1、108M-1、107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合第二抗原。在一些实施方案中，所述第二抗原结合区以大于107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合所述第二抗原。在一些实施方案中，所述第一抗原结合区结合所述第一抗原时的结合亲和力比所述第二抗原结合区结合所述第二抗原时的结合亲和力大至少100倍、1000倍或10000倍。在一些实施方案中，所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区至少90％、95％、99％或100％相同。在一些方面，本公开涉及一种双特异性抗体或抗原结合片段，包括：包含第一重链可变区和第一轻链可变区的第一臂，包含第二重链可变区和第二轻链可变区的第二臂；其中所述第一臂以大于107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、或1012M-1的结合亲和力特异性结合第一抗原，并且所述第二臂以小于109M-1、108M-1、107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合第二抗原。在一些实施方案中，所述第二臂以大于107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合所述第二抗原。在一些实施方案中，所述第一臂结合所述第一抗原时的结合亲和力比所述第二臂结合所述第二抗原时的结合亲和力大至少100倍、1000倍或10000倍。在一些实施方案中，所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区至少90％、95％、99％或100％相同。在一些方面，本公开涉及一种双特异性抗体或抗原结合片段，其包含：含有第一重链可变区的第一重链、含有第二重链可变区的第二重链、含有第一轻链可变区的第一轻链、和含有第二轻链可变区的第二轻链，其中，所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区彼此缔合，形成第一抗原结合区，所述第一抗原结合区以大于107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、或1012M-1的结合亲和力特异性结合第一抗原，并且所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区彼此缔合，形成第二抗原结合区，所述第二抗原结合区以小于109M-1、108M-1、107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合第二抗原。在一些实施方案中，所述第二抗原结合区以大于107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合所述第二抗原。在一些实施方案中，所述第一抗原结合区结合所述第一抗原时的结合亲和力比所述第二抗原结合区结合所述第二抗原时的结合亲和力大至少100倍、1000倍或10000倍。在一些实施方案中，所述第一轻链和所述第二轻链至少90％，95％，99％或100％相同。在一些实施方案中，所述第一重链和第二链通过杵臼结构的方式彼此缔合。在一些实施方案中，所述第一抗原是癌症特异性抗原，并且所述第二抗原是CD3。在一些实施方案中，所述第一抗原是CD20，并且所述第二抗原是CD3。在一些实施方案中，所述第一重链可变区包含与SEQIDNO：1至少80％、85％、90％或95％相同的序列，所述第二重链可变区包含与SEQIDNO：2至少80％、85％、90％或95％相同的序列，并且所述第一和第二轻链可变区包含与SEQIDNO：3至少80％、85％、90％或95％相同的序列。在一些实施方案中，所述第一抗原是癌症特异性抗原，并且所述第二抗原是癌症相关抗原。在一些实施方案中，所述第一抗原是PD-L1，所述第二抗原是CD55。在一些实施方案中，所述第一重链可变区包含与SEQIDNO：4至少80％、85％、90％或95％相同的序列，所述第二重链可变区包含与SEQIDNO：5至少80％、85％、90％或95％相同的序列，并且所述第一和第二轻链可变区包含与SEQIDNO：6或SEQIDNO：7至少80％、85％、90％或95％相同的序列。在一些方面，本公开涉及一种制备双特异性抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括：选择第一抗原和第二抗原，并鉴定与所述第一抗原结合的第一抗体或其抗原结合片段以及与所述第二抗原结合的第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其抗原结合片段包含第一重链可变区(VHa)和第一轻链可变区(VLa)，并且所述第二抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区(VHb)和第二轻链可变区(VLb)；确定VHa、VLa、VHb和VLb的氨基酸序列；比对VLa和VLb的氨基酸序列，并确定VLa和VLb之间的序列同源性大于80％；设计共同的轻链可变区(VLc)，其中当VLc与VHa缔合时，所述VLc保持对所述第一抗原的亲和力；重新设计VHa和VHb序列，从而获得VHa'和VHb'，以增加第一蛋白质和第二蛋白质之间的生物化学或生物物理特征的差异，其中所述第一蛋白质包含两个各自含有VHa'的多肽和两个各自含有VLc的多肽，并且所述第二蛋白质包含两个各自含有VHb'的多肽和两个各自含有VLc的多肽；产生具有两个轻链可变区和两个重链可变区的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述两个轻链可变区各自包含VLc，并且所述两个重链可变区分别包含VHa'和VHb'。在一些实施方案中，在步骤(d)中，VLc-VHb与所述第二抗原的结合亲和力可以降低。在一些实施方案中，该方法进一步包括开发缓冲液系统以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：/n第一重链可变区，/n第二重链可变区，/n第一轻链可变区，和/n第二轻链可变区，/n其中，所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区彼此缔合，形成第一抗原结合区，所述第一抗原结合区以大于10

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170801 US 62/539,970;20180406 US 62/654,1121.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
第一重链可变区，
第二重链可变区，
第一轻链可变区，和
第二轻链可变区，
其中，所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区彼此缔合，形成第一抗原结合区，所述第一抗原结合区以大于107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、或1012M-1的结合亲和力特异性结合第一抗原，并且
所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区彼此缔合，形成第二抗原结合区，所述第二抗原结合区以小于109M-1、108M-1、107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合第二抗原。


2.根据权利要求1所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合区以大于107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合所述第二抗原。


3.根据权利要求1所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合区结合所述第一抗原时的结合亲和力比所述第二抗原结合区结合所述第二抗原时的结合亲和力大至少100倍、1000倍或10000倍。


4.根据权利要求1所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区至少90％、95％、99％或100％相同。


5.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
包含第一重链可变区和第一轻链可变区的第一臂；和
包含第二重链可变区和第二轻链可变区的第二臂；
其中所述第一臂以大于107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、或1012M-1的结合亲和力特异性结合第一抗原，并且所述第二臂以小于109M-1、108M-1、107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合第二抗原。


6.根据权利要求5所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第二臂以大于107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合所述第二抗原。


7.根据权利要求5所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一臂结合所述第一抗原时的结合亲和力比所述第二臂结合所述第二抗原时的结合亲和力大至少100倍、1000倍或10000倍。


8.根据权利要求5所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区至少90％、95％、99％或100％相同。


9.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：
含有第一重链可变区的第一重链，
含有第二重链可变区的第二重链，
含有第一轻链可变区的第一轻链，和
含有第二轻链可变区的第二轻链，
其中，所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区彼此缔合，形成第一抗原结合区，所述第一抗原结合区以大于107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、或1012M-1的结合亲和力特异性结合第一抗原，并且
所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区彼此缔合，形成第二抗原结合区，所述第二抗原结合区以小于109M-1、108M-1、107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合第二抗原。


10.根据权利要求9所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合区以大于107M-1、106M-1、105M-1、或104M-1的结合亲和力特异性结合所述第二抗原。


11.根据权利要求9所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合区结合所述第一抗原时的结合亲和力比所述第二抗原结合区结合所述第二抗原时的结合亲和力大至少100倍、1000倍或10000倍。


12.根据权利要求9所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一轻链和所述第二轻链至少90％，95％，99％或100％相同。


13.根据权利要求9所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链和第二链通过杵臼结构的方式彼此缔合。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一抗原是癌症特异性抗原，并且所述第二抗原是CD3。


15.根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一抗原是CD20，并且所述第二抗原是CD3。


16.根据权利要求15所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一重链可变区包含与SEQIDNO：1至少80％、85％、90％或95％相同的序列，所述第二重链可变区包含与SEQIDNO：2至少80％、85％、90％或95％相同的序列，并且所述第一和第二轻链可变区包含与SEQIDNO：3至少80％、85％、90％或95％相同的序列。


17.根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一抗原是癌症特异性抗原，并且所述第二抗原是癌症相关抗原。


18.根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一抗原是PD-L1，所述第二抗原是CD55。


19.根据权利要求18所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一重链可变区包含与SEQIDNO：4至少80％、85％、90％或95％相同的序列，所述第二重链可变区包含与SEQIDNO：5至少80％、85％、90％或95％相同的序列，并且所述第一和第二轻链可变区包含与SEQIDNO：6或SEQIDNO：7至少80％、85％、90％或95％相同的序列。


20.一种制备双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(a)选择第一抗原和第二抗原，并鉴定与所述第一抗原结合的第一抗体或其抗原结合片段以及与所述第二抗原结合的第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其抗原结合片段包含第一重链可变区(VHa)和第一轻链可变区(VLa)，并且所述第二抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区(VHb)和第二轻链可变区(VLb)；
(b)确定VHa、VLa、VHb和VLb的氨基酸序列；
(c)比对VLa和VLb的氨基酸序列，并确定VLa和VLb之间的序列同源性大于80％；
(d)设计共同的轻链可变区(VLc)，其中当VLc与VHa缔合时，所述VLc保持对所述第一抗原的亲和力；
(e)重新设计VHa和VHb序列，从而获得VHa'和VHb'，以增加第一蛋白质和第二蛋白质之间的生物化学或生物物理特征的差异，其中所述第一蛋白质包含两个各自含有VHa'的多肽和两个各自含有VLc的多肽，并且所述第二蛋白质包含两个各自含有VHb'的多肽和两个各自含有VLc的多肽；并且
(f)产生具有两个轻链可变区和两个重链可变区的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述两个轻链可变区各自包含VLc，并且所述两个重链可变区分别包含VHa'和VHb'。


21.根据权利要求20所述的方法，其中在步骤(d)中，VLc-VHb与所述第二抗原的结合亲和力可以降低。


22.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(g)开发缓冲液系统以纯化所述双特异性抗体或其抗原结合片段。


23.一种制备双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(a)选择第一抗原和第二抗原，并鉴定与所述第一抗原结合的第一抗体或其抗原结合片段以及与所述第二抗原结合的第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其抗原结合片段包含第一重链可变区(VHa)和第一轻链可变区(VLa)，并且所述第二抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区(VHb)和第二轻链可变区(VLb)；
(b)确定VHa、VLa和VLb的氨基酸序列；
(c)比对VLa和VLb的氨基酸序列，并确定VLa和VLb之间的序列同源性小于80％；
(d)用VLa替换噬菌体展示抗体文库中的所有轻链可变区，并针对所述第二抗原进行淘选以获得第三重链可变区(VHc)；
(e)重新设计VHa和VHc序列，从而获得VHa'和VHc'，以增加第一蛋白质和第二蛋白质之间的生物化学或生物物理特征的差异，其中所述第一蛋白质包含两个各自含有VHa'的多肽和两个各自含有VLa的多肽，并且所述第二蛋白质包含两个各自含有VHc'的多肽和两个各自含有VLa的多肽；并且
(f)产生具有两个轻链可变区和两个重链可变区的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述两个轻链可变区各自包含VLa，并且所述两个重链可变区分别包含VHa'和VHc'。


24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述方法进一步包括：
(g)开发缓冲液系统以纯化所述双特异性抗体或其抗原结合片段。


25.一种制备双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(a)选择第一抗原和第二抗原，并鉴定与所述第一抗原结合的第一抗体或其抗原结合片段以及与所述第二抗原结合的第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其抗原结合片段包含第一重链可变区(VHa)和第一轻链可变区(VLa)，并且所述第二抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区(VHb)和第二轻链可变区(VLb)；
(b)确定VHa、VLa、VHb和VLb的氨基酸序列；
(c)比对VLa和VLb的氨基酸序列，并确定VLa和VLb之间的序列同源性小于80％；
(d)用多个轻链可变区替换噬菌体展示抗体文库中的所有轻链可变区，其中所述轻链可变区与VLa或VLb至少80％、85％、90％、95％或99％相同；
(e)针对所述第二抗原进行淘选；
(f)选择共同的轻链可变区(VLc)和第三重链可变区(VHc)，其中VHa-VLc以期望的亲和力结合所述第一抗原并且VHc-VLc以期望的亲和力结合所述第二抗原；
(g)重新设计VHa和VHc序列，从而获得VHa'和VHc'，以增加第一蛋白质和第二蛋白质之间的生物化学或生物物理特征的差异，其中所述第一蛋白质包含两个各自含有VHa'的多肽和两个各自含有VLc的多肽，并且所述第二蛋白质包含两个各自含有VHc'的多肽和两个各自含有VLc的多肽；并且
(h)产生具有两个轻链可变区和两个重链可变区的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述两个轻链可变区各自包含VLc，并且所述两个重链可变区分别包含VHa'和VHc'。


26.根据权利要求25所述的方法，其中，在步骤(d)中，所述多个轻链可变区是通过易错PCR产生的。


27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述方法进一步包括：
(i)开发缓冲系统以纯化所述双特异性抗体或其抗原结合片段。


28.一种制备双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(a)选择第一抗原和第二抗原，并鉴定与所述第一抗原结合的第一抗体或其抗原结合片段以及与所述第二抗原结合的第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其抗原结合片段包含第一重链可变区(VHa)和第一轻链可变区(VLa)，并且所述第二抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区(VHb)和第二轻链可变区(VLb)；
(b)确定VHa、VLa、VHb和VLb的氨基酸序列；
(c)比对VLa和VLb的氨基酸序列，并确定VLa和VLb之间的序列同源性小于80％；
(d)用多个轻链可变区替换噬菌体展示抗体文库中的所有轻链可变区，其中所述轻链可变区与VLa或VLb至少80％、85％、90％、95％或99％相同；
(e)针对所述第二抗原进行淘选；
(f)选择共同的轻链可变区(VLc)和第三重链可变区(VHc)，其中VHc-VLc以期望的亲和力与所述第二抗原结合；
(g)确定VLa与VLc之间的同源性大于80％；
(h)设计共同的轻链可变区(VLd)，其中当所述VLd与VHa缔合时，所述VLd保持对所述第一抗原的亲和力，而且当所述VLd与VHc缔合时，所述VLd对所述第二抗原具有期望的亲和力；
(i)任选地，重新设计VHa和VHc序列，从而获得VHa'和VHc'，以增加第一蛋白质和第二蛋白质之间的生物化学或生物物理特征的差异，其中所述第一蛋白质包含两个各自含有VHa'的多肽和两个各自含有VLd的多肽，并且所述第二蛋白质包含两个各自含有VHc'的多肽和两个各自含有VLd的多肽；并且
(j)任选地，产生具有两个轻链可变区和两个重链可变区的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述两个轻链可变区各自包含VLd，并且所述两个重链可变区分别包含VHa'和VHc'。


29.一种制备双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(a)选择第一抗原和第二抗原，并鉴定与所述第一抗原结合的第一抗体或其抗原结合片段以及与所述第二抗原结合的第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其抗原结合片段包含第一重链可变区(VHa)和第一轻链可变区(VLa)，并且所述第二抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区(VHb)和第二轻链可变区(VLb)；
(b)确定VHa、VLa、VHb和VLb的氨基酸序列；
(c)比对VLa和VLb的氨基酸序列，并确定VLa和VLb之间的序列同源性大于80％；
(d)设计共同的轻链可变区(VLc)，其中当所述VLc与VHa缔合时，所述VLc保持对所述第一抗原的亲和力；并且
(e)任选地，产生具有两个轻链可变区和两个重链可变区的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述两个轻链可变区各自包含VLc，并且所述两个重链可变区分别包含VHa和VHb。


30.一种制备双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(a)选择第一抗原和第二抗原，并鉴定与所述第一抗原结合的第一抗体或其抗原结合片段以及与所述第二抗原结合的第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其抗原结合片段包含第一重链可变区(VHa)和第一轻链可变区(VLa)，并且所述第二抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变区(VHb)和第二轻链可变区(VLb)；
(b)确定VHa、VLa和VLb的氨基酸序列；
(c)比对VLa和VLb的氨基酸序列，并确定VLa和VLb之间的序列同源性小于80％；
(d)用所述VLa替换噬菌体展示抗体文库中的所有轻链可变区，并针对所述第二抗原进行淘选，以获得第三重链可变区(VHc)；并且
(e)任选地，产生具有两个轻链可变区和两个重链可...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘悦，蔡文燕，石家栋，
申请(专利权)人：AB工作室有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US