葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因制造技术

本发明专利技术公开了葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因，包括如下步骤：S1、选取对照组：选取自然生长的“峰早”葡萄和利用蒸馏水处理后的“巨峰”葡萄；S2、实验组处理：将300mmol/L的H

【技术实现步骤摘要】
葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因
本专利技术涉及生物
，具体为葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因。
技术介绍
葡萄是世界上栽培最为广泛的果树之一，葡萄是世界性的水果，用途很广，不仅大量用以鲜食，还用来酿造不同类型的葡萄酒，加工成葡萄干、葡萄汁等。早熟葡萄是蒴果作物的一个重要属性，发展早熟葡萄生产促使葡萄提早上市，不仅迎合消费者喜好，更能提高葡萄经济效益推动农业生产发展。因此，研究葡萄早熟机制具有重要意义,早熟葡萄新品种“峰早”是“巨峰”的芽变，该品种果穗圆锥形、穗形中大，于河南省洛阳地区发现，浆果7月上旬成熟，成熟期比“巨峰”早30天左右。通过对葡萄品种“巨峰”与“峰早”发育特征比较分析，发现芽变与亲本间果胶甲酯酶(PE)活性和多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性变化模式相一致，且芽变的PG酶活性增长速率均明显大于其亲本，这种变化幅度也与早熟芽变性状变化的幅度相关，所以PG酶活性增加加快了芽变品种的成熟软化，这可能是芽变比亲本早熟的原因之一，基于以上生理研究，我们用5-AC和H2O2处理“巨峰”葡萄，5-AC和H2O2都是已知可以有效促进果实成熟的试剂。通过比较这两种处理的转录组数据，分析结果表明GDSL型酯酶/脂肪酶(GELP)基因表达在这两种处理中均差异显著。可见，GELP基因家族在葡萄果实发育成熟中发挥重要作用。GDSL酯酶/脂肪酶(GELP)广泛存在于各种生物当中，主要参与植物发育、形态发生、次生代谢产物合成和防御反应的调控。成熟的GELP与不同底物(包括酰基辅酶A、多种酯类和氨基酸衍生物)具有广泛的水解活性,并且GDSL酯酶与木聚糖去乙酰化和次生壁模式有关。在桃中报道2个GELP基因参与果实发育成熟，葡萄中与果实发育相关的GELP基因尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶(GELP)标志基因，本专利技术通过对过氧化氢(H2O2)促早熟处理的后“巨峰”葡萄和未处理的“峰早”葡萄进行实时荧光定量处理，同时对葡萄果实发育相关的候选VvGELP基因的筛选，表明VvGELP76有可能发挥胞壁降解酶的功能在葡萄早熟机制中发挥重要作用，为深入了解葡萄中GDSL酯酶/脂肪酶(GELP)基因家族的功能和对葡萄早熟的深入研究提供理论依据。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶(GELP)标志基因，包括如下步骤：S1、选取对照组：选取自然生长的“峰早”葡萄和利用蒸馏水处理后的“巨峰”葡萄；S2、实验组处理：将300mmol/L的H2O2均匀喷涂在“巨峰”葡萄上，其中，第一次喷施为开花后25天，第二次为开花后35天，每个过程重复三次，每次重复五棵树；S3、收集材料：每次采样从上午9点开始，用锡纸包起来，立即放入液氮罐中；S4、采集样本：每棵树随机抽取30个样本，记录果实发育的物候期数据，其中采样时间为葡萄果实发育关键时间点分别是2017年6月12日、6月21日、7月1日、7月12日；S5、葡萄中GDSL型酯酶/脂肪酶基因家族鉴定；S6、多序列比对和系统发育分析；S7、葡萄中GELP基因的表达分析；S8、RNA提取和实时荧光定量(qRT-PCR)；S9、与葡萄果实发育相关的候选VvGELP基因的筛选：(1)采用TIANGEN试剂盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”葡萄的果实总RNA；(2)回收PCR产物；(3)构建载体并与目的基因连接，将重组后的载体质粒转入大肠杆菌；(4)利用ExPASy在线分析工具对VvGELP76基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析。优选的，S5中，从Pfam网站中，下载GDSL型酯酶/脂肪酶结构域序列，利用隐马尔可夫模型软件HMMER进行比对搜索葡萄中的GELP基因，将得到的GELP基因蛋白序列用Clustalx进行比对建立新的HMM文件，然后利用HMMER软件搜索葡萄中GELP基因，将得到的基因提交到SMART和CDD网站进行结构认证，保留其中含有GELP保守结构域的的基因，数据处理中去掉重复基因以及基因中包含“N”的个数大于全长的30％的基因，并保留同一基因不同可变剪切中最长的氨基酸序列，利用ExPASy在线分析工具对葡萄GELP基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析。优选的，S6中，用鉴定出的VvGELP基因蛋白序列与23个其他物种功能已知的GELP基因蛋白序列在MEGA7.0中构建系统发育树，并将参数设置为：homogeneouspattern；pairwisedeletion；bootstrap值1000。23个功能已知的GELP蛋白序列从UniProt数据库下载。优选的，S7中，VvGELP基因的FPKM值来自RNA-seq数据，数据处理过程：计算每次生物学重复平均FPKM值，并取值log10，利用软件R将数据可视化。优选的，S8中，用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒对H2O2处理和对照的“巨峰”以及未处理“峰早”果实提取RNA，随后用TaKaRa反转录试剂盒，反转录合成cDNA，作为模板用于PCR扩增。优选的，在采用TIANGEN试剂盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”葡萄的果实总RNA中，以总RNA为模版，反转录合成cDNA，利用Primer3设计特异性引物，克隆VvGELP76基因全长的引物序列为：VvGELP76Forward：AACTGTGGTCGTCTTCTCG，VvGELP76Reverse：CCACGCATTTCTGGATGATC，以反转录生成的cDNA为模板与基因的简并引物进行PCR扩增，PCR扩增，反应程序为：95℃预变性3min；95℃20s，58℃30s，72℃30s，35个循环；最后，72℃延伸5min。优选的，在回收PCR产物中，PCR扩增目的基因片段采用50μL体系，每个基因扩增两管，之后将相同两管PCR产物点进同一个胶孔内，切下目的基因位置凝胶，使用康为世纪胶回收试剂盒，回收胶之后立即进行T-A克隆。优选的，在构建载体并与目的基因连接，将重组后的载体质粒转入大肠杆菌中，大肠杆菌转化需预先配置LB培养基，实际用量：细菌培养用胰蛋白胨0.5g、细菌培养用酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g、琼脂粉0.75g，50mL蒸馏水。优选的，在利用ExPASy在线分析工具对VvGELP76基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析中，用SignalP-5.0进行信号肽分析，利用PSORTPrediction进行亚细胞定位预测，用TMHMMServerv.2.0进行跨膜结构域分析。本专利技术提供了葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶(GELP)标志基因，具备以下有益效果：本专利技术通过对过氧化氢(H2O2)促早熟处理的后“巨峰”葡萄和未处理的“峰早”葡萄进行实时荧光定量展示VvGELP76基因在不同发育时期H2O2处理前后基因表达比对照显著上升，并且基因表达趋势与对照趋势一样且与转录组表达模式一致，说明VvGELP76基因在葡萄果实生长发育起本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、选取对照组：选取自然生长的“峰早”葡萄和利用蒸馏水处理后的“巨峰”葡萄；/nS2、实验组处理：将300mmol/L的H

【技术特征摘要】
20191016 CN 20191098136301.葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因，其特征在于，包括如下步骤：
S1、选取对照组：选取自然生长的“峰早”葡萄和利用蒸馏水处理后的“巨峰”葡萄；
S2、实验组处理：将300mmol/L的H2O2均匀喷涂在“巨峰”葡萄上，其中，第一次喷施为开花后25天，第二次为开花后35天，每个过程重复三次，每次重复五棵树；
S3、收集材料：每次采样从上午9点开始，用锡纸包起来，立即放入液氮罐中；
S4、采集样本：每棵树随机抽取30个样本，记录果实发育的物候期数据，其中采样时间为葡萄果实发育关键时间点分别是2017年6月12日、6月21日、7月1日、7月12日；
S5、葡萄中GDSL型酯酶/脂肪酶基因家族鉴定；
S6、多序列比对和系统发育分析；
S7、葡萄中GELP基因的表达分析；
S8、RNA提取和实时荧光定量；
S9、与葡萄果实发育相关的候选VvGELP基因的筛选：
(1)采用TIANGEN试剂盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”葡萄的果实总RNA；
(2)回收PCR产物；
(3)构建载体并与目的基因连接，将重组后的载体质粒转入大肠杆菌；
(4)利用ExPASy在线分析工具对VvGELP76基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析。


2.根据权利要求1所述的葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因，其特征在于：S5中，从Pfam网站中，下载GDSL型酯酶/脂肪酶结构域序列，利用隐马尔可夫模型软件HMMER进行比对搜索葡萄中的GELP基因，将得到的GELP基因蛋白序列用Clustalx进行比对建立新的HMM文件，然后利用HMMER软件搜索葡萄中GELP基因，将得到的基因提交到SMART和CDD网站进行结构认证，保留其中含有GELP保守结构域的的基因，数据处理中去掉重复基因以及基因中包含“N”的个数大于全长的30％的基因，并保留同一基因不同可变剪切中最长的氨基酸序列。葡萄基因组序列从EnsemblePlants数据库下载。利用ExPASy在线分析工具对葡萄GELP基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析。


3.根据权利要求1所述的葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因，其特征在于：S6中，用鉴定出的VvGELP基因蛋白序列与23个其他物种功能已知的GELP基因蛋白序列在MEGA7.0中构建系统发育树，并将参数设置为：homogeneouspattern；pairwisedelet...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭大龙，余义和，郭丽丽，张国海，郑玉萍，尼沛艺，姬晓汝，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41