与花椰菜蜡质相关的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与花椰菜蜡质相关的分子标记及应用，所述分子标记的核苷酸序列为GACTC，其存在于蜡质正常花椰菜8号染色体，并且开发了用于蜡质有无花椰菜辅助筛选的PCR引物，具有共显性、特异性强、稳定性好等优点，在58℃不产生非特异扩增，能够十分准确地检测出待测花椰菜材料是否为蜡质缺失。采用本发明专利技术的引物CaGL1‑F/CaGL1‑R进行蜡质缺失花椰菜的辅助筛选，在幼苗期就能够快速筛选出目标株系，大大提高育种效率。

Molecular markers related to cauliflower wax and their application

【技术实现步骤摘要】
与花椰菜蜡质相关的分子标记及应用
本专利技术属于分子标记
，具体涉及一种与花椰菜蜡质相关的分子标记及应用。
技术介绍
育种过程中最重要的环节之一就是目标性状的选择，选择目标性状的过程其实就是选择基因型的过程。然而在常规育种过程中，育种家通常都是根据肉眼观察到的表型来进行选择，很难获知后代的基因型，且耗时较长、选择效率低下。随着分子生物学的飞速发展，利用分子标记辅助选择结合常规杂交育种来进行新品种选育已得到广泛应用。分子标记辅助选择具有准确、快速、不受环境干扰的优点，可以快速检测到与目标性状基因紧密连锁的基因或位点，进而选择出目标性状，大大缩短育种进程。花椰菜属于十字花科芸薹属(Brassica)甘蓝类蔬菜，由于其营养丰富、质地柔嫩、味道鲜美，深受广大消费者的喜爱，近年来栽培面积和消费量迅速增长，目前花椰菜已成为国内外蔬菜市场的主要蔬菜种类之一。随着生活水平的提高，人们对高营养、高品质蔬菜的需求逐渐提高，对品种类型也要求多样化。受表皮蜡质的影响，甘蓝类作物的茎、叶等地上部组织表现为绿色、深绿色或灰绿色等，蜡缺失突变体是由正常材料突变而来，其茎、叶等组织表皮覆盖蜡质极少，表现为有光泽的亮绿色，商品性好。此外前人还报道蜡质缺失突变体叶片薄，脆嫩，口感更好，可生食，Vc含量高，食用品质佳。所以在育种过程中得到蜡质缺失的花椰菜材料具有十分重要的意义。本专利技术的专利技术人在生产实践的过程中发现1份花椰菜蜡质缺失的突变体材料cagl-1，通过表型来看，其叶片、茎、荚等器官表面缺乏蜡质，表现为油绿，同时其表现为湿度敏感不育：常规条件下高度不育，高湿(＞80％)度条件下育性恢复，类似于拟南芥cer1、cer3、cer6等蜡质缺失突变体，可用于培育商品性较好的花椰菜芽菜品种，或用于基于雄性不育的杂交制种体系。开发与花椰菜蜡质相关的分子标记，可以为利用分子标记辅助选择培育蜡质缺失的花椰菜新品种提供有效支撑，同时大大缩短育种进程并提高选择的准确性，为蜡质缺失花椰菜分子育种奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与花椰菜蜡质相关的分子标记，该标记特异性强、稳定性好，能够快速有效地鉴定有/无蜡质材料。为实现上述目的，本专利技术采取如下技术方案：一种与花椰菜蜡质相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列为GACTC，其存在于蜡质正常花椰菜8号染色体，与蜡质正常/缺失紧密连锁。上述分子标记的PCR引物为：上游引物CaGL1-F：5’-GACGTACCTGGGAAGACCAA-3’，下游引物CaGL1-R：5’-AGTAACTCGACGGGATCAGC-3’。本专利技术还公开了上述分子标记在分子标记辅助育种中的应用以及在鉴定花椰菜蜡质是否缺失中的应用。当花椰菜基因型为GACTC/GACTC时，其为蜡质正常的纯合株；当花椰菜基因型为-/-时，其为蜡质缺失的纯合株；当花椰菜基因型为GACTC/-时，其为蜡质正常的杂合株。其中鉴定花椰菜蜡质是否缺失的方法，具体为：(1)取待测花椰菜叶片组织，提取基因组DNA，稀释至约40ng/μL；(2)以步骤⑴所获得的基因组DNA为模板，利用引物对CaGL1-F、CaGL1-R进行PCR反应，获得PCR产物；(3)使用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测获得的PCR产物，使用快速银染法检测产物是包含GACTC/GACTC还是GACTC/-还是-/-；如果能扩增出如SEQIDNO.1所示的160bp的特征条带，则所检测材料为纯合的蜡质正常花椰菜；如果能扩增出如SEQIDNO.2所示的155bp的特征条带，则所检测材料为纯合的蜡质缺失花椰菜。并且在试验中还发现，表型为蜡质正常花椰菜材料，还存在上述两个特征条带的情况，所以还存在，如果既能扩增出如SEQIDNO.1所示的160bp的特征条带也能扩增出如SEQIDNO.2所示的155bp的特征条带，则所述材料为杂合的蜡质正常花椰菜。上述方法中，所述PCR反应的体系为：PCR反应总体积为20μL，其中10μmol/L的上下游引物各1.0μL，北京全式金生物PCRSuperMixforPAGE(货号AS112-11)10μL，40ng/μL的模板DNA4μL，ddH2O4μL。上述方法中，所述PCR反应的条件为：所述PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。上述方法中，所述8％聚丙烯酰胺凝胶电泳方法为：按每块胶加入6mL40％Acr-Bis、3mL10×TBE、21mLddH2O、250μL、10％APS、25μLTemed；将配好的胶混匀，从凹槽处小心灌入玻璃板，插好梳子；聚丙烯酰胺凝胶凝固后，装入电泳槽，用夹子固定；向电泳槽中加入0.5×TBE缓冲液，将梳子拔出；用微量移液枪将PCR样本加入点样孔；插上电源，在160V条件下电泳70分钟。上述方法中，所述银染方法为：将胶放入固定液中，固定液包含450mL蒸馏水、50mL无水乙醇和2.5mL冰醋酸，摇床上摇晃12min；倒掉固定液，在500mL蒸馏水中加入1gAgNO3混匀，银染12min；倒掉银染液，加入500mL蒸馏水清洗30s,重复清洗1次；倒掉蒸馏水，加入显色液，包含500mL蒸馏水、7.5gNaOH和1.5mL甲醛，显色8min。上述方法或PCR标记检测应用中，所述花椰菜包括如下品种中的任一种：cagl-1、C-8、SHC-1、SHC-2、SHC-3、SHC-4、SHC-5、SHC-6、SHC-7、SHC-8、JHC-1、JHC-2、JHC-3、JHC-4、JHC-5、JHC-6、JHC-7、JHC-8、优松60、津松75、津品56、津品70。另外，包含所述的分子标记引物对的试剂盒也落入本专利技术的保护范围之内。本专利技术具有如下优点：本专利技术开发了用于蜡质有无花椰菜辅助筛选的PCR引物，具有共显性、特异性强、稳定性好等优点，在58℃不产生非特异扩增，能够十分准确地检测出待测花椰菜材料是否表现为蜡质缺失。采用本专利技术的引物CaGL1-F/CaGL1-R进行蜡质缺失花椰菜的辅助筛选，在幼苗期就能够快速筛选出目标株系，并且与田间表型吻合率达到100％。本专利技术可以用于蜡质缺失花椰菜辅助筛选的方法，该方法操作简单易行，只需提取待测花椰菜的基因组DNA，采用引物CaGL1-F/CaGL1-R进行PCR反应，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物特征条带的长短，即可判断出待测植株中是否为蜡质缺失花椰菜。利用本专利技术提供的PCR标记进行花椰菜蜡质有无的筛选，操作简单易行，能大大缩短育种周期，提高育种效率。附图说明图1表示在不同花椰菜自交系中引物的扩增情况，其中，M：DNAmarker；cagl-1，蜡质缺失花椰菜突变体；wt，野生型亲本C-8；花椰菜Ca1-Ca15：蜡质正常花椰菜材料，分别为：SHC-1、SHC-2、SHC-3、SHC-4、SHC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与花椰菜蜡质相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列为GACTC，其存在于蜡质正常花椰菜8号染色体。/n

【技术特征摘要】
1.与花椰菜蜡质相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列为GACTC，其存在于蜡质正常花椰菜8号染色体。


2.根据权利要求1所述的与花椰菜蜡质相关的分子标记，其特征在于，其分子标记引物为：
上游引物CaGL1-F：5'-GACGTACCTGGGAAGACCAA-3’，
下游引物CaGL1-R：5'-AGTAACTCGACGGGATCAGC-3’。


3.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的分子标记引物在花椰菜分子标记辅助育种中的应用。


4.权利要求1所述的分...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小丽，孙德岭，姚星伟，单晓政，文正华，牛国保，刘莉莉，江汉民，
申请(专利权)人：天津科润农业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12