本发明专利技术公开了一种DNA水平快速鉴定地肤子与其混伪品的方法，包括如下步骤：1)提取样品地肤子DNA；2)以待测样品DNA为模板，PCR扩增ITS2序列的片段；3)将PCR产物正向测序，经过ITS2 database剪切获得地肤子ITS2序列；4)进行NJ系统发育树构建、种内及种间平均遗传距离分析、二级结构特征比较。结果表明地肤子ITS2序列聚类成一支独立进化枝，地肤子种内平均遗传距离显著小于地肤子与其混伪品种间平均遗传距离，且地肤子ITS2二级结构与混伪品的差异明显，说明ITS2序列作为快速准确鉴定地肤子与其混伪品。本发明专利技术方法操作简单、分辨率高，客观性、适用性和重复性强，能够实现可快速准确鉴定地肤子与其混伪品。
A rapid identification method of Fructus Kochiae and its adulterants based on ITS2 sequence
【技术实现步骤摘要】
一种基于ITS2序列快速鉴定地肤子与其混伪品的方法
本专利技术涉及一种基于ITS2序列快速鉴定地肤子与其混伪品的方法。
技术介绍
地肤子为藜科地肤属植物地肤(Kochiascoparia(L.)Schrad.)的干燥成熟果实，全国各地普遍分布。其性味辛、苦、性寒，归肾、膀胱经，具有清热利湿、祛风止痒等功效，主治小便涩痛、阴痒带下、风疹、湿疹、皮肤瘙痒等症。外用能够杀虫止痒。现代药理学研究表明，地肤子主要含三萜皂苷、脂肪油以及黄酮类等化学成分，其中地肤子总皂苷可抑制速发型变态反应，地肤子油对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、链球菌等均有一定的抑菌作用。地肤子的乙醇提取物对自由基有一定的清除能力；此外还有降血糖、诱导细胞凋亡和抑制癌细胞侵袭转移作用。随着地肤子的医疗价值被开发，并且科研工作人员在致力寻找天然抗氧剂中发现地肤子的提取物对DPPH自由基显现出较强的清除能力，因而市场对其需求越来越大。但是，近年来市场和临床上出现蛇床子、草木犀、天仙子、黑芝麻、茺蔚子、土荆芥、小藜、藜与地肤子混用的现象。譬如，哈丽达等人在检验工作中发现地肤子伪品藜，常与中药地肤子混用约1/3~1/5，有时整批伪充。胡云峰曾报道在临床治疗中，地肤子被误认为天仙子而混用，致使病人出现口干舌燥、视力模糊、心率加快等症状，继而出现神志不清。因此，混伪品扰乱中药材市场的秩序，影响地肤子的用药疗效及安全，为确保临床用药安全有效，急需寻求一种精准可靠的方法应用于鉴别地肤子与其混伪品。目前，传统的中药材鉴定主要通过经验鉴别的方法，从形态色泽、种子的外观形态以及颜色、气味、切片等来鉴定药材的真伪与纯度；通过基原鉴定、性状鉴定和显微鉴定方法主要利用中药的外观性状和显微特征进行鉴定。如车光迅等通过性状和理化性质鉴别了地肤子与其混伪品藜、天仙子。刘媛文通过性状和理化性质鉴别了地肤子与其混伪品土荆芥。但此类传统鉴别方法要求鉴定员必须具有丰富而扎实的分类学知识和鉴别经验。与传统中药鉴定技术相比，DNA条形码技术是根据一段公认的、标准的短序列进行物种鉴定的分子诊断技术，摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的束缚，打破传统形态学物种鉴定的局限性，不受鉴定对象环境、个体发育和人为因素影响等优点，能直接从基因水平上提供鉴定依据，将有助于非药物分类学家对药用植物快速、准确的鉴定，是传统鉴定方法的有效补充。DNA条形码技术具有操作简单、分辨率高、准确高效、客观性、适用性和重复性强等的特点。近年来DNA条形码技术及其相关领域应用研究已成为生物学活跃的研究领域和新的热点话题之一，是未来物种鉴定的发展趋势。中药鉴定的常用序列有matK、rbcL、psbA-trnH和ITS2。不同DNA条形码优缺点各不相同，例如matK引物通用性差,难以进行序列扩增和测序；rbcL序列虽然具有通用性、易扩增、易比对的优点,但变异性不显著，鉴定效率较低；psbA-trnH比较容易设计通用引物,但序列重复结构较多，且测序的成功率较低；ITS2具有较好的稳定性与准确性优点,能快速鉴定物种。陈士林等比较了7种DNA条形码片段(psbA-trnH,matK,rbcL,rpoC1,ycf5,ITS2,andITS)后发现核糖体DNA的ITS2为最合适的DNA条形码且验证ITS2在物种鉴定中的鉴定效率高达92.7%，并提出以ITS2为鉴定植物类群的核心识别条形码。ITS2(internaltranscribedspacer2)序列是去除两端5.8SrRNA序列和28SrRNA序列的核糖体DNA序列间隔区,具有良好的通用性,片段足够短并且易扩增、测序等优点。ITS2序列足够的变异位点是确保准确鉴定、维持物种鉴定成功率的前提。ITS2序列的鉴定能力已在多个科属基原植物及植物类药材中得到验证,能够鉴定种类繁多、数量庞大的药用植物及其密切相关的物种。因此，本专利技术利用ITS2序列对地肤子与其混伪品（草木犀、蛇床子、天仙子、茺蔚子、黑芝麻、土荆芥、藜、小藜）进行DNA分子鉴定，为地肤子的快速准确鉴定及用药安全提供科学依据。
技术实现思路
本专利技术的目的：本专利技术提供一个利用核糖体DNA的ITS2片段快速准确鉴别地肤子与其混伪品的方法，以此弥补传统性状、组织显微鉴别等方法鉴别地肤子的技术不足和局限性，确保用药安全。本专利技术包括以下步骤，如下。步骤1提取待测地肤子样品DNA（植物组织DNA快速提取试剂盒法天根DP305）。步骤2PCR扩增含有核糖体DNA的ITS2序列。引物序列采用ITS2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'和ITS3R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。PCR扩增反应采用50μL体系：包括模板DNA4μL、正向引物和反向引物各0.7μL，PrimeSTAR®HSPremix25μL，ddH2O19.6μL。PCR扩增程序为94℃预变性2min，1个循环；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，40个循环；72℃最后延伸5min，进行1个循环，4℃保存扩增产物。步骤3用电泳琼脂糖凝胶电泳检测。步骤4将PCR产物交由华大基因公司进行正向测序，经过ITS2database剪切获得地肤子ITS2序列。步骤5通过GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下载地肤子与其混伪品的ITS2序列集。步骤6NJ系统发育树的构建、种内及种间平均遗传距离分析、二级结构特征比较。步骤7鉴定判断：假设NJ系统发育树中地肤子的ITS2序列聚类在一起，地肤子种内平均遗传距离显著小于地肤子与其混伪品的种间平均遗传距离，且地肤子的二级结构与混伪品二级结构差异大，则说明ITS2序列是可作为一种快速准确鉴定地肤子与其混伪品的方法。本专利技术的优点及其效果，如下。（1）与传统的形态学鉴定、理化鉴定等方法鉴别地肤子相比，本专利技术优点在于结果准确、重复性好、鉴定简单易行、客观性强、专业技术要求低和适用性强，获得的ITS2序列有助于实现地肤子药材与天仙子、茺蔚子、草木犀等混伪品的快速高效鉴定。（2）本专利技术通过NJ系统发育树构建、种内及种间平均遗传距离分析、二级结构特征比较多角度验证ITS2序列可快速鉴定地肤子与其混伪品，避免鉴定指标单一性，提高鉴定准确率。具体实施例实施例一，如下。步骤1.DNA提取（植物组织DNA快速提取试剂盒法，天根DP305）。（1）取干重组织约30mg，加入液氮充分碾磨。（2）将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700µl65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。（3）加入700µl氯仿，充分混匀，12,000rpm(~13,400×g)离心5min。注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。（4）小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于ITS2序列快速鉴定地肤子与其混伪品的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）提取待测地肤子样品DNA，PCR扩增含有核糖体DNA的ITS2序列，将 PCR 产物正向测序，经过ITS2 database剪切获得地肤子ITS2序列；（2）采用ClustalW方法进行多重序列比对，应用MEGA 6.06软件构建NJ系统发育树（Neighbor-Joining tree），利用Bootstrap法进行1000次重复分析，检验各系统发育枝的支持率，分析各物种分支是否具有单系性；（3）应用MEGA 6.06软件基于双参数模型Kimura two-parameter (K2P)计算种内与种间平均遗传距离；（4）通过ITS2 database (http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de)预测地肤子及其混伪品ITS2二级结构；（5）如果NJ树中地肤子的ITS2序列聚类在一起，地肤子种内平均遗传距离显著小于地肤子与其混伪品的种间平均遗传距离，且地肤子二级结构与其混伪品二级结构差异大，说明ITS2序列可快速准确鉴定地肤子与其混伪品。/n
【技术特征摘要】
1.一种基于ITS2序列快速鉴定地肤子与其混伪品的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）提取待测地肤子样品DNA，PCR扩增含有核糖体DNA的ITS2序列，将PCR产物正向测序，经过ITS2database剪切获得地肤子ITS2序列；（2）采用ClustalW方法进行多重序列比对，应用MEGA6.06软件构建NJ系统发育树（Neighbor-Joiningtree），利用Bootstrap法进行1000次重复分析，检验各系统发育枝的支持率，分析各物种分支是否具有单系性；（3）应用MEGA6.06软件基于双参数模型Kimuratwo-parameter(K2P)计算种内与种间平均遗传距离；（4）通过ITS2database(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de)预测地肤子及其混伪品ITS2二级结构；（5）如果NJ树中地肤子的ITS2序列聚类在一起，地肤子种内平均遗传距离显著小于地肤子与其混伪品的种间平均遗传距离，且地肤子二级结构与其混伪品二级结构差异大，说明IT...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈镜安，黄遵楠，刘镛，李斯璐，李琳，吕思敏，成雪梅，谢静怡，叶子欣，尹晓晴，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。