检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及2019新型冠状病毒的检测领域，能够检测2019新型冠状病毒的两个碱基突变（8782C→T和28144T→C）。本发明专利技术提供了一种用于检测2019新型冠状病毒突变的组合物；同时，还提供了含该组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测2019新型冠状病毒突变的方法。使用本发明专利技术的组合物，为细化新冠肺炎诊断提供了依据，确定患者病毒的型别，对临床特征和病情发展进行预判，据此更新并改进治疗方案。

Novel coronavirus mutant 2019 detection composition, use and kit

【技术实现步骤摘要】
检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒
本专利技术属于分子生物学检测领域；具体地，属于2019新型冠状病毒的检测领域；更具体地，能够检测2019新型冠状病毒的两个碱基突变（8782C→T和28144T→C）。
技术介绍
2019新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是引发新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎，COVID-19）的病原体。该病毒在2019年下半年开始流行并迅速蔓延，世界卫生组织于2020年3月11日宣布全球大流行。截至2020年4月1日，全球累计确诊新冠肺炎病例已超过80万例，且有进一步恶化趋势。新冠肺炎常见体征有发热、咳嗽、气促和呼吸困难等呼吸道症状。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，进一步导致死亡。目前对于2019新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，但许多症状可以对症进行辅助护理和支持性治疗。XiaoluTang等人通过病毒全基因分析，发现在第8782位碱基和第28144位碱基存在连锁现象（101/103，98%）。例如，根据这两个碱基的类型，新冠病毒存在两种单倍型：L型（C8782和T28144）和S型（T8782和C28144）。其中L型和S型的命名来自于28144位碱基变化后编码的不同氨基酸，其中L型的T28144所在密码子编码亮氨酸（Leucine），S型的C28144所在密码子编码丝氨酸（Serine）。通过数据对比分析，L型和S型在重症率和传染能力上存在差异。这为细化新冠肺炎诊断提供了依据，意味着临床上可通过基因分型检测，确定患者体内病毒的型别，对临床特征和病情发展进行预判，据此制定更具针对性的治疗方案。因此，检测识别2019新型冠状病毒这两个位点的碱基，对于疫情防控和确诊病患的治疗有积极的意义。但目前尚未有相应检测试剂。本领域需要一种能够将2019新型冠状病毒8782和28144两个位点的碱基进行检测并识别的相关产品。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种检测2019新型冠状病毒突变的组合物，所述组合物包括：第一核酸组合物：8782C型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTCATC-3’（SEQIDNO:1）；28144T型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCAGATT-3’（SEQIDNO:2）；和第二核酸组合物：8782T型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTATCGT-3’（SEQIDNO:3）；28144C型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTTTGC-3’（SEQIDNO:4）；其中，所述每个核酸组合物中还包括：8782反向引物：5’-CCATTAGTTGTGCGTAATATCGT-3’（SEQIDNO:5）；8782探针：5’-CTTGCCCATTGATTGCTGCAGTCATAA-3’（SEQIDNO:6）；28144反向引物：5’-CAACACGAACGTCATGATACTCTA-3’（SEQIDNO:7）；28144探针：5’-ATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAGT-3’（SEQIDNO:8）。使用该组合物，可以分辨2019新型冠状病毒的8782位为C型或T型，并且可以分辨28144为T或C型）。通过检测两处碱基类型，可以例如区分新冠病毒的S型和L型，为细化新冠肺炎诊断提供了依据，确定患者病毒型别，对临床特征和病情发展进行预判，据此更新并改进治疗方案，对于疫情防控和确诊病患的治疗有积极的意义。使用本专利技术的组合物，引物检测扩增特异性靶标的Ct值小，扩增效率高；引物检测特异性模板的Ct值和非特异性模板的Ct值差值大，特异性好。而使用本专利技术的组合物的对比例，引物检测扩增特异性靶标的Ct值大于本专利技术组合物，其扩增效率较低，同时，特异性模板的Ct值和非特异性模板的Ct值差值也较本专利技术组合物小，其特异性也相对较差。本专利技术的组合物可用于荧光定量PCR检测。进一步地，所述组合物中，8782探针与28144探针带有彼此不互相干扰的荧光报告基团。在本文中，“彼此不互相干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光报告基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。进一步地，所述组合物包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。在本专利技术中，荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。在一个具体的实施方案中，如SEQIDNO:6所示的8782探针的荧光报告基团为HEX；如SEQIDNO:8所示的28144探针的荧光报告基团为FAM。进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。进一步地，所述组合物中引物的用量为25~800nM；所述组合物中探针的用量为10~500nM。在一个具体的实施方案中，本专利技术组合的两种核酸组合物分别存在于单独包装中。进一步地，本专利技术的组合物的各成分以混合的形式存在。第二方面，本专利技术提供了上述本专利技术的组合物在制备检测2019新型冠状病毒突变的试剂盒中的用途。第三方面，本专利技术提供了一种检测2019新型冠状病毒突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述本专利技术的组合物。进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、TritonX-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20-200µl。在一个具体的实施方案中，本专利技术第一核酸组合物的具体成分如下所示：在一个具体的实施方案中，本专利技术第二核酸组合物的具体成分如下所示：更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、逆转录酶以及DNA聚合酶中的至少一种。进一步地，所述组合物中检测引物的25~800nM；所述组合物中探针的用量为10~500nM。进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/μL~15U/μL，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶（MMLV）或者Tth酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/μL~15U/μL，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照。所述阳性对照含有2019新型冠状病毒基因组第8782位附近的序列以及第28144位附近的序列，并且其中，第8782位为C或T，且第28144位为C或T。例如，第8782位为C且第28144位为T，8782位为T且第28144位为C，第8782位为C且第28144位为C，第8782位为T且第28144位为T。在本文中，术语“第8782位”和“第28144位”是指Genebank登录号为：NC_045512.2的新型冠状病毒基因组序列的第8782位和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测2019新型冠状病毒突变的组合物，所述组合物包括：/n第一核酸组合物：/n8782 C型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTCATC-3’（SEQ ID NO:1）；/n28144 T型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCAGATT-3’（SEQ ID NO:2）；和/n第二核酸组合物：/n8782 T型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTATCGT-3’（SEQ ID NO:3）；/n28144 C型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTTTGC-3’（SEQ ID NO:4）；/n其中，所述每个核酸组合物中还包括：/n8782反向引物：5’-CCATTAGTTGTGCGTAATATCGT-3’（SEQ ID NO:5）；/n8782探针：5’-CTTGCCCATTGATTGCTGCAGTCATAA-3’（SEQ ID NO:6）；/n28144反向引物：5’-CAACACGAACGTCATGATACTCTA-3’（SEQ ID NO:7）；/n28144探针：5’-ATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAGT-3’（SEQ ID NO:8）。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测2019新型冠状病毒突变的组合物，所述组合物包括：
第一核酸组合物：
8782C型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTTCATC-3’（SEQIDNO:1）；
28144T型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCAGATT-3’（SEQIDNO:2）；和
第二核酸组合物：
8782T型正向引物：5’-GCTGATTTTGACACATGGTATCGT-3’（SEQIDNO:3）；
28144C型正向引物：5’-ATCGGTAATTATACAGTTTCCTTTGC-3’（SEQIDNO:4）；
其中，所述每个核酸组合物中还包括：
8782反向引物：5’-CCATTAGTTGTGCGTAATATCGT-3’（SEQIDNO:5）；
8782探针：5’-CTTGCCCATTGATTGCTGCAGTCATAA-3’（SEQIDNO:6）；
28144反向引物：5’-CAACACGAACGTCATGATACTCTA-3’（SEQIDNO:7）；
28144探针：5’-ATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAGT-3’（SEQIDNO:8）。


2.根据权利要求1所述的组合物，其中，8782...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓中平，戴立忠，颜进，陈诗谣，任小梅，刘佳，郭鑫武，谭德勇，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43