新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温检测试剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供了新型小鹅痛风病毒(N‑GoAstV)的一步法环介导等温检测试剂及其应用，涉及病毒检测技术领域。本发明专利技术根据N‑GoAstV基因保守区设计合成特异性LAMP引物，包括上游内引物FIP、下游内引物BIP、上游外引物F3、下游外引物B3，上游环状引物LF和下游环状引物LB，检测试剂包括如下组分：10×反应缓冲液、dNTPs、MgSO

One step loop mediated isothermal detection reagent for Gosling gout virus and its application

【技术实现步骤摘要】
新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温检测试剂及其应用
本专利技术涉及病毒检测
，特别是涉及新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温检测试剂及其应用。
技术介绍
致痛风新型小鹅星状病毒(GooseAstrovirus,N-GoAstV)属于星状病毒科的成员之一，由于其发现时间较短，属种还未确定。致痛风新型小鹅星状病毒是一种无囊膜的直径为28-30nm的球形颗粒，其衣壳蛋白呈20面体结构。N-GoAstV感染广泛流行于雏鹅中，主要引起雏鹅的肠炎，肾炎，以9-12日龄的感染率最高。由于此年龄阶段，雏鹅体内来自母体抗体水平下降，加上环境污染和预防不及时，一旦感染对机体产生极大损伤。感染后多表现为高热、腹泻、花斑肾，拉白色稀粪。其病理变化表现为多内脏器官有大量的尿酸盐沉积，肾脏细胞有出血、肾小管上皮细胞坏死和尿酸盐颗粒沉积；肝细胞尿酸盐颗粒沉积和空泡变性；脾细胞有出血和坏死并伴有不同程度的病理病变。N-GoAstV与鹅细小病毒(GPV)或其他病毒性疾病混合感染时，容易引起继发病症，增加宿主死亡风险。N-GoAstV病毒感染动物模型用于研究病毒重要基因在病毒感染过程的作用以及筛选毒株。以期为研究致痛风新型小鹅星状病毒病的发病机理、评价和预测抗病毒药物的疗效提供重要依据。核酸扩增是基因诊断技术中最常用的方法之一，目前核酸扩增的方法有聚合酶链式反应(PCR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、自主序列复制(SR)以及链置换技术(SDA)等，都能将微量标本进行快速扩增，但在特异性、简便程度、温度和试剂仪器要求等方面各有缺点。>
技术实现思路
本专利技术的一个目的是要提供新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温检测试剂及其应用，缩短了检测时间，提高了特异性和敏感性，以及提高了操作的方便性、降低了成本。特别地，本专利技术提供了用于新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温扩增引物组，所述引物组由以下引物组成：上游内引物FIP：TGACGACATTCGYGTCRTAATTAAT-GATAATGTCACCATGATTTGCT；下游内引物BIP：TGTGGGTTAAACCAGAAAATGTCA-GAATTC-CGTAAGACCACAGAAAGTCAT；上游外引物F3：CGACGCTCARTTACTYAGG；下游外引物B3：ACCATCACTCCTTTTAAYCAA；上游环状引物LF：CCTTCCTTATTGACACAAGCCTAT下游环状引物LB：AGGTCTCTGATGATATTGAGGGT。根据本专利技术的另一个方面，新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温扩增检测试剂，所述试剂为致痛风新型小鹅星状病毒的等温检测试剂，所述试剂包括上面所述的引物组。优选的，所述试剂还包括如下组分：10×反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、Bst3.0DNA聚合酶、去离子水、模板RNA和显色试剂。优选的，所述试剂中Mg2+的浓度为6mmol·L-1。优选的，所述试剂中dNTPs的浓度为1.5mmol·L-1；作为优选，所述试剂中显色试剂为酚红与甲酚红混合指示剂。优选的，所述试剂还包括阳性对照。根据本专利技术的另一个方面，由试剂得到试剂盒，新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温扩增检测试剂盒，所述试剂盒为致痛风新型小鹅星状病毒的等温检测试剂盒，所述试剂盒包括上面任一项所述的环介导等温扩增检测试剂。根据上面任一项所述的检测试剂或所述的检测试剂盒在如下任一种条件下的应用：一、不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测致痛风新型小鹅星状病毒；二、制备用于检测或辅助检测致痛风新型小鹅星状病毒的产品；三、不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染致痛风新型小鹅星状病毒；四、制备用于检测或辅助检测待测动物样品是否感染致痛风新型小鹅星状病毒的产品；五、不以疾病的诊断和治疗为目的的检测待测病毒是否为致痛风新型小鹅星状病毒；六、制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为致痛风新型小鹅星状病毒的产品。对于检测动物样品来说，一种检测或辅助检测待测动物样品是否感染致痛风新型小鹅星状病毒的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：反应步骤：从待测动物组织样品提取基因组RNA作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行环介导等温扩增，得到扩增产物；作为优选，所述环介导等温扩增的反应条件为：恒温61℃反应30分钟；确认步骤：按照下述任一方法确定待测动物样品是否感染致痛风新型小鹅星状病毒：A、扩增产物呈现黄色则待测动物样品感染致痛风新型小鹅星状病毒；扩增产物呈现紫红色则待测动物样品未感染致痛风新型小鹅星状病毒；B、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物样品感染致痛风新型小鹅星状病毒；仅有一条引物电泳条带，则待测动物样品未感染致痛风新型小鹅星状病毒。对于检测病毒本身来说，一种检测或辅助检测待测病毒为致痛风新型小鹅星状病毒的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：反应步骤：从待测样品中提取基因组的RNA作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行一步法反转录环介导等温扩增，得到扩增产物；作为优选，所述环介导等温扩增的反应条件为：恒温61℃，反应30分钟；确认步骤：按照下述任一方法确定待测病毒是否为致痛风新型小鹅星状病毒：A、扩增产物呈现黄色则待测病原是致痛风新型小鹅星状病毒；扩增产物呈现紫红色则待测病毒不是致痛风新型小鹅星状病毒；B、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物病毒是致痛风新型小鹅星状病毒；仅有一条引物电泳条带，则待测病毒不是致痛风新型小鹅星状病毒。本专利技术提供了一种致痛风新型小鹅星状病毒的一步法反转录环介导等温扩增检测试剂及其应用，主要有以下几点有益效果：1、本专利技术使用三对特异性引物，六个识别区域，相对现有的检测方法，特异性更高。2、本专利技术检测致痛风新型小鹅星状病毒的的环介导等温试剂盒具有高灵敏性：将ORF1b序列的标准质粒进行10倍递进稀释后作为LAMP反应模板，以同样的模板浓度用PCR方法进行检测，结果表明：LAMP方法具有与定量PCR扩增的方法相同的检测灵敏度。由此可见，本专利技术LAMP方法具有很高的灵敏度。3、本专利技术检测致痛风新型小鹅星状病毒的的环介导等温试剂盒具有高特异性：将临床上常见的鹅类病毒性疾病：GPV(鹅细小病毒)、NDHV(新型鸭肝炎病毒)(鹅星状病毒FLX、AHDY合成序列)、GREOV(鹅呼肠孤病毒)、TBSV(坦布苏病毒)和GHPV(鹅出血性多瘤病毒)分别作为检测对象，用本专利技术的方法进行检测，仅N-GoAstV为阳性，具有高特异性。4、本专利技术检测致痛风新型小鹅星状病毒的的环介导等温试剂具有快速性：相对普通PCR反应数小时的反应时间和检测时间，本专利技术检测方法1个小时内即可完成整本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温扩增引物组，其特征在于：所述引物组由以下引物组成：/n上游内引物FIP：/nTGACGACATTCGYGTCRTAATTAAT-GATAATGTCACCATGATTTGCT；/n下游内引物BIP：/nTGTGGGTTAAACCAGAAAATGTCA-GAATTC-CGTAAGACCACAGAAAGTCAT；/n上游外引物F3：CGACGCTCARTTACTYAGG；/n下游外引物B3：ACCATCACTCCTTTTAAYCAA；/n上游环状引物LF：CCTTCCTTATTGACACAAGCCTAT/n下游环状引物LB：AGGTCTCTGATGATATTGAGGGT。/n

【技术特征摘要】
1.新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温扩增引物组，其特征在于：所述引物组由以下引物组成：
上游内引物FIP：
TGACGACATTCGYGTCRTAATTAAT-GATAATGTCACCATGATTTGCT；
下游内引物BIP：
TGTGGGTTAAACCAGAAAATGTCA-GAATTC-CGTAAGACCACAGAAAGTCAT；
上游外引物F3：CGACGCTCARTTACTYAGG；
下游外引物B3：ACCATCACTCCTTTTAAYCAA；
上游环状引物LF：CCTTCCTTATTGACACAAGCCTAT
下游环状引物LB：AGGTCTCTGATGATATTGAGGGT。


2.新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温扩增检测试剂，其特征在于：所述试剂包括权利要求1中所述的引物组。


3.根据权利要求2所述的环介导等温扩增检测试剂，其特征在于：所述试剂还包括如下组分：10×反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、Bst3.0DNA聚合酶、去离子水、模板RNA和显色试剂。


4.根据权利要求3所述的环介导等温扩增检测试剂，其特征在于：所述试剂中Mg2+的浓度为6mmol·L-1。


5.根据权利要求3所述的环介导等温扩增检测试剂，其特征在于：所述试剂中dNTPs的浓度为1.5mmol·L-1；作为优选，所述试剂中显色试剂为酚红与甲酚红混合指示剂。


6.根据权利要求3所述的环介导等温扩增检测试剂，其特征在于：所述试剂还包括阳性对照。


7.新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求2-6任一项所述的环介导等温扩增检测试剂。


8.权利要求2-6中任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒在如下任一种条件下的应用：
一、不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测致痛风新型小鹅星状病毒；
二、制备用于检测或辅助检测致痛风新型小鹅星状病毒的产品；
三、不以疾...

【专利技术属性】
技术研发人员：冀君，陈钦玺，刘强，许鑫，慕新浩，张志斌，余政利，随朝鸽，阚云超，姚伦广，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41