一种肝素C5异构酶高催化活性菌株的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种肝素C5异构酶高催化活性菌株的构建方法，属于生物工程技术领域。本方法首先选用大肠杆菌作为宿主菌，然后利用N端融合促溶标签的方法对C5异构酶进行表达优化，将优化后的C5蛋白序列进一步通过分子对接进行蛋白质工程改造，得到高活性的生产菌株。本发明专利技术首次采用微生物细胞表达106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸后的C5，得到的酶催化活性为5.81U/mL，相比未突变前提高了141％，比酶活为145.14U/mg，相比未突变前提高了128％。

Construction of a high catalytic activity strain of heparin C5 isomerase

【技术实现步骤摘要】
一种肝素C5异构酶高催化活性菌株的构建方法
本专利技术涉及一种肝素C5异构酶高催化活性菌株的构建方法，属于生物工程

技术介绍
肝素(Heparin)和硫酸乙酰肝素(Heparinsulfate)是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺通过交替连接而成的，是由肝素前体经过一系列变构化及硫酸化作用而形成的一种直链带负电荷的线性多糖。肝素存在于动物细胞的表面或胞外基质中，临床上主要用于治疗血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术和术后抗凝血等。目前肝素的生产方法有生物提取法、化学酶法合成、全酶法合成。生物提取法主要是从动物小肠粘膜中提取，但动物组织中同时含有硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等一系列其他的糖胺聚糖，易造成提取的肝素被污染；化学法生产周期长，过程繁琐；酶法合成产物单一，过程简单。为了得到结构均一性较好、生物安全的肝素，利用微生物进行肝素的合成可以有效避免上述问题。肝素C5异构酶催化葡萄糖醛酸5-COOH发生翻转形成艾杜糖醛酸，但目前肝素C5异构酶表达量低，催化活性低，不利于工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种肝素C5异构酶突变体，所述肝素C5异构酶突变体的构建方法是：首先肝素C5异构酶的N端融合促溶标签SET2，然后通过分子改造获得肝素C5异构酶突变体；所述分子改造包括(1)-(6)中的任意一种：(1)将肝素C5异构酶的106位氨基酸(按照建模时的序号计，应为153位氨基酸)由缬氨酸突变为精氨酸；(2)将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸；(3)将肝素C5异构酶的498位氨基酸(按照建模时的序号计，应为545位氨基酸)由天冬氨酸突变为精氨酸；(4)将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸；(5)将肝素C5异构酶的352位氨基酸(按照建模时的序号计，应为399位氨基酸)由甘氨酸突变为谷氨酸；(6)将肝素C5异构酶的350位氨基酸(按照建模时的序号计，应为397位氨基酸)由赖氨酸突变为丙氨酸；所述肝素C5异构酶来源于斑马鱼(Daniorerio)，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；所述SET2来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。编码所述肝素C5异构酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码SET2的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第二个目的是提供编码上述肝素C5异构酶突变体的基因。本专利技术的第三个目的是提供含上述基因的质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述质粒包括pCold系列质粒。本专利技术的第四个目的是表达上述肝素C5异构酶突变体的基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主包括大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术的第五个目的是提供一种提高肝素C5异构酶催化活性的方法，首先肝素C5异构酶的N端融合酿酒酵母的促溶标签SET2，然后通过分子改造获得肝素C5异构酶突变体；所述分子改造包括(1)-(6)中的任意一种：(1)将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸；(2)将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸；(3)将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为精氨酸；(4)将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸；(5)将肝素C5异构酶的352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸；(6)将肝素C5异构酶的350位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸；所述肝素C5异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；所述SET2的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术的第六个目的是提供一种生产肝素C5异构酶的方法，是以上述基因工程菌为生产菌株，诱导发酵生产肝素C5异构酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是向OD600为0.6-0.8的生产菌株培养物中，加入IPTG，12-25○С，200-220rpm诱导发酵。本专利技术还提供了上述肝素C5异构酶突变体在食品、化工或制药领域的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术首次采用微生物细胞中以pCold系列载体表达斑马鱼来源的C5，得到的酶催化活性为1.87U/mL。本专利技术首次采用微生物细胞表达N端融合促溶标签SET2的C5，得到的酶催化活性为2.41U/mL，相比对照提高了29％。本专利技术首次采用微生物细胞表达106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸后的C5，得到的酶催化活性为5.81U/mL，相比未突变前提高了141％，比酶活为145.14U/mg，相比未突变前提高了128％。本专利技术首次采用微生物细胞表达106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸后的C5，得到的酶催化活性为2.80U/mL，相比未突变前提高了16％，比酶活为70U/mg，相比未突变前提高了10％。本专利技术首次采用微生物细胞表达498位氨基酸由天冬氨酸突变为精氨酸后的C5，得到的酶催化活性为2.82U/mL，相比未突变前提高了17％，比酶活为70.5U/mg，相比未突变前提高了11％。本专利技术首次采用微生物细胞表达498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸后的C5，得到的酶催化活性为4.29U/mL，相比未突变前提高了78％，比酶活为107.2U/mg，相比未突变前提高了69％。本专利技术首次采用微生物细胞表达352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸后的C5，得到的酶催化活性为3.83U/mL，相比未突变前提高了59％，比酶活为95.8U/mg，相比未突变前提高了51％。本专利技术首次采用微生物细胞表达350位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸后的C5，得到的酶催化活性为3.16U/mL，相比未突变前提高了31％，比酶活为78.9U/mg，相比未突变前提高了24％。附图说明图1是肝素C5异构酶催化过程图。图2是肝素C5异构酶N端融合促溶标签SET2的质粒图谱。图3是肝素C5异构酶N端融合MBP、SUMO、SET2后的蛋白电泳图(A)和酶活(B)，其中，泳道1：maker；泳道2：E.coliBL21(DE3)-pColdIII-MBP-C5胞内上清；泳道3：E.coliBL21(DE3)-pColdIII-SUMO-C5胞内上清；泳道4：E.coliBL21(DE3)-pColdIII-SET2-C5胞内上清；泳道5：对照胞内上清；泳道6：对照胞内沉淀；泳道7：E.coliBL21(DE3)-pColdIII-MBP-C5胞外沉淀；泳道8：E.coliBL21(DE3)-pColdIII-SUMO-C5胞内沉淀；泳道9：E.coliBL21(DE3)-pColdIII-SET2-C5胞内沉淀。图4是各个肝素C5异构酶突变体的酶活图，图中V153R、V153K、D545R、D545Y、G399E、K397A中的氨基酸序列是按照建模时的序号计算，分别对应实施例2中的C5-V106R、C5-V106K、C5-D49本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝素C5异构酶突变体，其特征在于，所述肝素C5异构酶突变体的构建方法是：首先肝素C5异构酶的N端融合促溶标签SET2，然后通过分子改造获得肝素C5异构酶突变体；所述分子改造包括(1)-(6)中的任意一种：/n(1)将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸；/n(2)将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸；/n(3)将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为精氨酸；/n(4)将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸；/n(5)将肝素C5异构酶的352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸；/n(6)将肝素C5异构酶的350位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸；/n所述肝素C5异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SET2的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝素C5异构酶突变体，其特征在于，所述肝素C5异构酶突变体的构建方法是：首先肝素C5异构酶的N端融合促溶标签SET2，然后通过分子改造获得肝素C5异构酶突变体；所述分子改造包括(1)-(6)中的任意一种：
(1)将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸；
(2)将肝素C5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸；
(3)将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为精氨酸；
(4)将肝素C5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸；
(5)将肝素C5异构酶的352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸；
(6)将肝素C5异构酶的350位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸；
所述肝素C5异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；所述SET2的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。


2.编码权利要求1所述的肝素C5异构酶突变体的基因。


3.含权利要求2所述的基因的质粒。


4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒包括pCold系列质粒。


5.表达权利要求1所述的肝素C5异构酶突变体的基因工程菌。


6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主包括大肠杆菌BL21(DE...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，王兵兵，周正雄，金学荣，胥睿睿，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32