一种L-阿拉伯糖异构酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种来源于益生菌‑青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis CICC 6178)的L‑阿拉伯糖异构酶基因、其编码酶，以及含有该基因的重组子。本发明专利技术公开的L‑阿拉伯糖异构酶BAAI具有优良的酶学特性，其最适pH为6.5，最适反应温度为55℃。本发明专利技术提供的L‑阿拉伯糖异构酶以D‑半乳糖为最佳底物，具有高效转化D‑半乳糖为D‑塔格糖的特点，转化率达到了90％，更有利于D‑塔格糖的生产，是制备功能性甜味剂D‑塔格糖的良好来源酶。

An L-arabinose isomerase and its application

【技术实现步骤摘要】
一种L-阿拉伯糖异构酶及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种L-阿拉伯糖异构酶及其应用。
技术介绍
D-塔格糖(D-Tagatose)是一种自然界中较为稀有的天然己酮糖，分子式为C6H12O6，相对分子质量为180.16。纯净的D-塔格糖为白色的晶体状物质，其甜味是蔗糖的92％，且无任何不良异味和余味。在高等动物包括人体中，只有少量的D-塔格糖能被小肠吸收，产生的热量仅为1.5kcal/g，不足蔗糖的1/3，因此D-塔格糖被认定为一种低热量甜味剂。D-塔格糖首先被发现于热带植物Sterculia(一种常青树)的树胶中，在苔藓、地衣等低等植物以及加热过的牛乳、乳粉、酸乳、干酪等乳制品中也少量存在，2001年美国食品与药物管理局(FDA)确认了D-塔格糖的食品安全性(GRAS)。D-塔格糖是一种具有低热量值、零血糖生成指数、血糖钝化作用、无龋齿性、益生元作用和抗氧化活性等优良营养特性的低热量甜味剂，并且具有改善肠道菌群、治疗Ⅱ型糖尿病、降低胆固醇、预防结肠癌等生理功效，因此被作为蔗糖的代替品应用于健康饮料及酸乳、果汁等产品中；同时还被广泛应用于糖尿病专用食品、减肥食品、口香糖、谷物食品、饮料、肉制品、糖果等工业中，并在医药行业被用于咳嗽糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的豁合剂及口腔消毒剂中。D-塔格糖作为一种稀有单糖，其理化性质和生理功能已经被证实，具有广阔的市场前景。D-塔格糖已在多个国家作为食品添加剂使用，但目前国内对于D-塔格糖的研究还未实现工业化生产，还处于实验室研究阶段，如何高效生产D-塔格糖丞待解决。D-塔格糖由于其稀少存在的特性使得天然提取法制备D-塔格糖难以实现，因此D-塔格糖的研究普遍利用化学法和生物法两种。化学法是以乳清或乳糖为原料，在酸或乳糖水解酶的作用下被水解为D-半乳糖和D-葡萄糖，再利用可溶性碱金属盐或碱土金属盐、铝酸钾等化学催化剂将D-半乳糖异构化成D-塔格糖。此方法存在副产物多、纯化烦琐和污染大等缺点，不利于工业化生产。生物法可以有效的克服这些缺点，目前报道的生物法生产D-塔格糖按原料不同分为两种方法：第一种是由Izumori课题组提出的，以半乳糖醇为原料，利用半乳糖醇脱氢酶将其氧化成D-塔格糖；或者以D-山梨糖为原料，在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和D-塔格糖-3-差向异构酶的催化下生成D-塔格糖。但是半乳糖醇和D-山梨糖的价格很高，该方法的商业应用价值不大。第二种是Cheetham等在1993年提出的，利用L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinoseisomerase，L-AI)将D-半乳糖转化为D-塔格糖。L-AI是将L-阿拉伯糖异构化为L-核酮糖的酶，由于D-半乳糖与L-阿拉伯糖结构上的相似性，L-AI又能将D-半乳糖异构化为D-塔格糖，因此该酶被广泛应用于制备D-塔格糖的研究。有文献报道，L-AI是目前用于生物法转化D-半乳糖生产D-塔格糖最有效的酶。其中，D-半乳糖又可经β-半乳糖苷酶水解廉价的奶制品工业废弃物乳清或乳糖获得。目前报道的L-AI的来源菌主要是嗜热菌和乳酸菌，来源于不同菌的L-AI的性质不同，不同理化特性的L-AI使得应用于D-塔格糖时生产效率存在不同。首先，L-AI的最适温度是影响D-塔格糖的生产的一大重要因素，最适温度升高，有利于反应向产物方向进行，因此，较高的反应温度可以提高D-塔格糖的产量。然而，当反应温度高于80℃时极易发生褐变反应，这对于食品工业的应用是非常不利的。因此，极端嗜热菌来源的L-AI不利于D-塔格糖的制备。其次，D-塔格糖在pH3-7之间可稳定存在，最适pH偏碱性的L-AI不利于产物D-塔格糖的积累，可引起副产物的产生；另一方面，D-塔格糖的生产可以廉价的乳清或乳糖为底物，而乳糖水解通常在酸性条件下进行，因此，筛选适应酸性条件的L-AI可以降低D-塔格糖的生产成本，简化生产工艺。但目前所报道的L-AI大部分是以碱性为最适pH，这不利于D-塔格糖工业化生产的实现。底物特异性研究显示，目前报道的L-AI几乎均是以L-阿拉伯糖为最佳底物，这导致L-AI用于转化D-半乳糖生产D-塔格糖存在转化率不高的问题。因此，寻找一种最适温度适宜、可适应酸性环境的、且以D-半乳糖为最佳底物的L-AI对于工业化制备获得转化率高的D-塔格糖具有重要的研究意义和实际应用价值。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种L-阿拉伯糖异构酶及其应用，所述L-阿拉伯糖异构酶具有优良的酶学特性，能以D-半乳糖为最佳底物，高效转化合成D-塔格糖。为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种L-阿拉伯糖异构酶BAAI，所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术提供了一种所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。优选的，本专利技术所述的L-阿拉伯糖异构酶BAAI来源于益生菌-青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)CICC6178。优选的，本专利技术所述SEQIDNO：2核苷酸序列由青春双歧杆菌的araA基因序列为模板，以SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示引物扩增得到。本专利技术提供了一种含有所述编码基因的重组子。优选的，所述重组子的基础质粒为pANY1。本专利技术提供了所述的L-阿拉伯糖异构酶BAAI、所述编码基因、所述重组子在合成D-塔格糖中的应用。优选的，所述应用为L-阿拉伯糖异构酶BAAI对底物D-半乳糖进行转化反应，得到D-塔格糖。优选的，所述转化反应的温度为50～70℃。优选的，所述转化反应的pH值为5-7。优选的，所述的D-半乳糖中添加有金属离子，所述金属离子优选为Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+中的一种或几种。所述Mn2+在底物中的浓度优选为5-8mM。本专利技术提供了一种L-阿拉伯糖异构酶BAAI，本专利技术所提供的L-阿拉伯糖异构酶BAAI来源于青春双歧杆菌，具有优良的酶学特性，最适pH为6.5，最适反应温度为55℃，与乳糖水解生成D-半乳糖的反应pH相契合，有利于乳糖到D-塔格糖的高效低成本生产，同时酸性条件下可减少副反应的发生。而且，本专利技术提供的L-阿拉伯糖异构酶能够以D-半乳糖为最佳底物，具有高效转化D-半乳糖为D-塔格糖的特点，转化率达到了90％，是制备功能性甜味剂D-塔格糖的良好来源酶，更有利于D-塔格糖的工业化生产。附图说明图1为青春双歧杆菌的araA基因PCR扩增结果；图2为青春双歧杆菌L-AI的表达及纯化结果；图3为青春双歧杆菌的L-AI的进化树分析结果；图4为青春双歧杆菌的L-AI的同源性分析结果；图5为青春双歧杆菌L-AI的酶学性质研究结果；其中，A为L-阿拉伯糖异构酶BAAI在不同温度下的相对酶活性；B为L-阿拉伯糖异构酶BAAI在不同温度下的稳定性试验结果；C为L-阿拉伯糖异构酶BAAI在不同pH值下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L-阿拉伯糖异构酶BAAI，其特征在于：所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种L-阿拉伯糖异构酶BAAI，其特征在于：所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.根据权利要求1所述的L-阿拉伯糖异构酶BAAI，其特征在于：所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI来源于益生菌-青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)CICC6178。


3.一种权利要求1所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述SEQIDNO：2核苷酸序列由青春双歧杆菌CICC6178的araA基因序列为模板，以SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示引物扩增得到。


5.一种含有权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐向辉，张国艳，员君华，袁娇，张宇飞，王洋，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32