一种用于检测烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体及其应用制造技术

一种烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体，所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQ ID NO.2所示的CDR1的氨基酸序列GYSITSGYY，SEQ ID NO.4所示的CDR2的氨基酸序列ISYDGSN和SEQ ID NO.6所示的CDR3的氨基酸序列FGKGY；轻链可变区序列包含SEQ ID NO.9所示的CDR1的氨基酸序列QSIVHSNGNTY，SEQ ID NO.11所示的CDR2的氨基酸序列KVS和SEQ ID NO.13所示的CDR3的氨基酸序列FQGSHVPWT。本发明专利技术提供一种烟草腺苷三磷酸酶(Apyrases，APY)的单克隆抗体及其应用，以解决现有技术存在的缺陷，本发明专利技术通过提供一个靶向蛋白研究的工具，使得对烟草和其它植物不同组织，不同生理条件下APY蛋白表达变化检测得以实现。

A monoclonal antibody for the detection of ATPase in tobacco and its application

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
腺苷三磷酸双磷酸酶(Apyrases，APY,EC3.6.1.5)，负责催化水解核苷三磷酸(NTP)和核苷二磷酸(NDP)中的磷酸酐键，形成核甘一磷酸(NMP)；该酶广泛存在于细菌、真菌、动物和植物中，其功能在哺乳动物中研究最为广泛，植物中则在土豆(Solanumtuberosum)、拟南芥(Arabidopsis)、棉花(Gossypiumhirsutum)、豌豆(Pisumsativum)、大豆(Glycinesoja)和苜蓿(Medicagotruncatula)被研究报道。在上述植物中的研究结果表明：Apyrases在调控植物生长和发育过程中发挥了多重作用，如调控纤维生长、气孔开合、抗寒性和花粉萌发生长等。研究报道指出，在快速生长的细胞中胞外Apyrases大量表达，如根尖生长区细胞、下胚轴细胞和花粉管细胞(Clarketal.,2010)，该类细胞能将胞内核苷酸运输至胞外，胞外Apyrases则能及时分解和调控胞外核苷酸的浓度(Wuetal.,2007)。目前，市面上并没有专门针对烟草腺苷三磷酸酶(Apyrases，APY)的靶向抗体，因此，在蛋白层面上，对于该研究领域缺乏有效的抗体工具，快速灵敏的检测腺苷三磷酸酶在蛋白水平的表达变化，用于在烟草和其它植物细胞生长和生殖授粉中APY的功能研究。
技术实现思路
本专利技术提供一种烟草腺苷三磷酸酶(Apyrases，APY)的单克隆抗体及其应用，以解决现有技术存在的缺陷，本专利技术通过提供一个靶向蛋白研究的工具，使得对烟草和其它植物不同组织，不同生理条件下APY蛋白表达变化检测得以实现。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种烟草腺苷三磷酸酶(Apyrases，APY)的单克隆抗体，a)所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQIDNO.2所示的CDR1的氨基酸序列GYSITSGYY、SEQIDNO.4所示的CDR2的氨基酸序列ISYDGSN和SEQIDNO.6所示的CDR3的氨基酸序列FGKGY；b)所述的单克隆抗体的轻链可变区序列包含SEQIDNO.9所示的CDR1的氨基酸序列QSIVHSNGNTY，SEQIDNO.11所示的CDR2的氨基酸序列KVS和SEQIDNO.13所示的CDR3的氨基酸序列FQGSHVPWT。进一步的，所述烟草腺苷三磷酸酶(Apyrases，APY)的单克隆抗体，其应用为：用于检测烟草不同组织腺苷三磷酸酶的表达量和定位。进一步的，所述烟草腺苷三磷酸酶(Apyrases，APY)的单克隆抗体，其应用为：用于检测不同授粉组合雌蕊腺苷三磷酸酶表达量和分布变化，研究腺苷三磷酸酶表达和授粉亲和性的相关性。进一步的，所述烟草腺苷三磷酸酶(Apyrases，APY)的单克隆抗体，其应用为：用于检测多种植物组织中腺苷三磷酸酶表达，用于植物中腺苷三磷酸酶的表达和功能研究。进一步的，所述烟草腺苷三磷酸酶(Apyrases，APY)的单克隆抗体，其应用为：用于在烟草雌蕊中开展免疫共沉淀鉴定腺苷三磷酸酶的互作蛋白，研究腺苷三磷酸酶的互作蛋白调控网络。进一步的，检测烟草不同组织腺苷三磷酸酶表达和定位的具体方法为：1)取烟草根、茎、叶、雌蕊、雄蕊和花粉管等组织和细胞材料，4％多聚甲醛固定，常规石蜡切片处理；2)切片按免疫荧光步骤处理，分别孵育本专利技术中的抗腺苷三磷酸酶一抗和荧光二抗；3)荧光显微镜观察不同组织中腺苷三磷酸酶的表达和定位。进一步的，检测多种植物中腺苷三磷酸酶表达的具体方法为：以不同植物的叶片为材料，BPP法提取总蛋白，开展免疫印迹实验。进一步的，检测不同授粉组合雌蕊腺苷三磷酸酶表达量变化的具体方法为：取不同授粉组合的雌蕊，4％多聚甲醛固定，常规石蜡切片处理，切片按免疫荧光步骤处理，荧光显微镜观察蛋白的表达量和定位。进一步的，鉴定腺苷三磷酸酶的互作蛋白的具体方法为：用烟草雌蕊总蛋白为材料开展免疫共沉淀，质谱鉴定获得蛋白，在烟草雌蕊中，腺苷三磷酸酶和ATP合成酶的α亚基互作。进一步的，一种检测工具，包括所述烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体，用于检测腺苷三磷酸酶，其为试剂盒、芯片或试纸。与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益效果：本专利技术通过原核表达烟草APY蛋白，以其作为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，经免疫印迹法、有限稀释法和ELISA法，得到能够产出高亲和性和高特异性的单克隆抗体的细胞株，及由细胞株分泌的单克隆抗体。本专利技术的一种烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体，对腺苷三磷酸酶具有高亲和力和高特异性，能广泛地用于对腺苷三磷酸酶检测上，特别是烟草不同组织部位腺苷三磷酸酶表达和定位，以及不同植物叶片中腺苷三磷酸酶表达；此外，本专利技术的单克隆抗体提供了一个靶向蛋白研究的工具，使得能通过免疫印迹法、酶联免疫法，免疫组化和免疫荧光法研究腺苷三磷酸酶的表达，并利用免疫共沉淀等技术深层次开展腺苷三磷酸酶蛋白互作调控网络研究。附图说明图1是不同烟草种花药和授粉雌蕊抗体的蛋白印记WB验证结果示意图；图2是Anti-APY抗体对目标蛋白的芯片识别效果图；图3是为Anti-APY抗体通过免疫荧光法检测烟草不同组织中APY表达；图4是Anti-APY抗体通过免疫印迹方法检测不同植物种叶片APY表达。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。如图所示：实施例1：一种腺苷三磷酸酶的单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗腺苷三磷酸酶单克隆抗体的制备和纯化1.1抗原的制备原核表达腺苷三磷酸酶全蛋白作为免疫原，总蛋白偶联VLP以及传统KLH系统的免疫原性增强因子。1.2免疫小鼠将抗原免疫6只Balb/c小鼠(8-12周龄)，并监测其血清效价以决定最优的免疫次数。优化了的佐剂和免疫方法能产生针对大多数抗原多肽的高亲和力的抗体(IgG亚型)。初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度(腺苷三磷酸酶的重组蛋白作为抗抗原包被)。滴度合格的小鼠将冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强，至滴度最高后融合。1.3血清检测和筛选免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA检测血清滴度(腺苷三磷酸酶的重组蛋白作为抗原包被)。血清效价需大于10K，否则继续加强免疫。1.4融合及筛选取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合。工艺为优化过的PEG融合。融合细胞铺到4块384孔板上(每孔细胞102到104)，进行培养。收集所有孔的上清，用ELISA对多肽检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养。生长几天后，收集所有孔的上清用ELISA检测与可溶片段检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体，其特征在于，/n1)所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQ ID NO.2所示的CDR1的氨基酸序列GYSITSGYY、SEQ ID NO.4所示的CDR2的氨基酸序列ISYDGSN和SEQ ID NO.6所示的CDR3的氨基酸序列FGKGY；/n2)所述的单克隆抗体的轻链可变区序列包含SEQ ID NO.9所示的CDR1的氨基酸序列QSIVHSNGNTY，SEQ ID NO.11所示的CDR2的氨基酸序列KVS和SEQ ID NO.13所示的CDR3的氨基酸序列FQGSHVPWT。/n

【技术特征摘要】
1.一种烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体，其特征在于，
1)所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQIDNO.2所示的CDR1的氨基酸序列GYSITSGYY、SEQIDNO.4所示的CDR2的氨基酸序列ISYDGSN和SEQIDNO.6所示的CDR3的氨基酸序列FGKGY；
2)所述的单克隆抗体的轻链可变区序列包含SEQIDNO.9所示的CDR1的氨基酸序列QSIVHSNGNTY，SEQIDNO.11所示的CDR2的氨基酸序列KVS和SEQIDNO.13所示的CDR3的氨基酸序列FQGSHVPWT。


2.根据权利要求1所述的一种烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体，其特征在于，其应用为：用于检测烟草不同组织腺苷三磷酸酶的表达量和定位。


3.根据权利要求1所述的一种烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体，其特征在于，其应用为：用于检测不同授粉组合雌蕊腺苷三磷酸酶表达量和分布变化，研究腺苷三磷酸酶表达和授粉亲和性的相关性。


4.根据权利要求1所述的一种烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体，其特征在于，其应用为：用于检测多种植物组织中腺苷三磷酸酶表达，用于植物中腺苷三磷酸酶的表达和功能研究。


5.根据权利要求1所述的一种烟草腺苷三磷酸酶的单克隆抗体，其特征在于，其应用为：用于在烟草雌蕊中通过免疫共沉淀鉴定腺苷三磷酸酶的互作蛋白，研究腺苷三磷酸酶的互作蛋白调控网络。

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【专利技术属性】
技术研发人员：陈穗云，廖菊够，陶柯良，魏雪梅，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南;53