【技术实现步骤摘要】
一种用于检测烟草多酚氧化酶的单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及单克隆抗体制备
，具体涉及一种用于检测烟草多酚氧化酶的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
多酚氧化酶(polyphenoloxidase,PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。1938年，Keilin和Mann在蘑菇中首次分离纯化得到PPO，开启对该酶的研究。PPO是一类Cu2+结合蛋白，由细胞核基因编码形成，主要定位在叶绿体的类囊体膜上，在细胞质和液泡(Onoetal.,2006)、高尔基体(Olmedoetal.,2018)、线粒体等细胞器上也有分布。根据催化底物的特异性和自身结构的不同，可以将PPO分为儿茶酚氧化酶(catecholoxidase,EC1.10.3.2)、酪氨酸酶(Tyrosinase,EC1.14.18.1)和漆酶(laccase,EC1.10.3.1)，其中酪氨酸酶主要分布在动物中，漆酶主要分布在微生物中，而植物中的PPO以儿茶酚氧化酶为主。植物中的PPO利用氧通过两种不同的反应完成对酚类物质的催化作用，第一种是催化单酚类物质...
【技术保护点】
1.一种用于检测烟草多酚氧化酶的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQ ID NO.2所示的CDR1的氨基酸序列GYTFTDYY，SEQ ID NO.4所示的CDR2的氨基酸序列INPYNGDT和SEQ ID NO.6所示的CDR3的氨基酸序列AREDYSGSSYVANFDY；/n所述的单克隆抗体的轻链可变区序列包含SEQ ID NO.9所示的CDR1的氨基酸序列KSLLHSNGITY，SEQ ID NO.11所示的CDR2的氨基酸序列QMS和SEQ ID NO.13所示的CDR3的氨基酸序列AQNLELWT。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于检测烟草多酚氧化酶的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQIDNO.2所示的CDR1的氨基酸序列GYTFTDYY，SEQIDNO.4所示的CDR2的氨基酸序列INPYNGDT和SEQIDNO.6所示的CDR3的氨基酸序列AREDYSGSSYVANFDY；
所述的单克隆抗体的轻链可变区序列包含SEQIDNO.9所示的CDR1的氨基酸序列KSLLHSNGITY，SEQIDNO.11所示的CDR2的氨基酸序列QMS和SEQIDNO.13所示的CDR3的氨基酸序列AQNLELWT。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测烟草多酚氧化酶的单克隆抗体，其特征在于；所述单克隆抗体的制备和纯化方法：
(1)抗原的制备
原核表达多酚氧化酶全蛋白作为免疫原，免疫原烟在草雌雄蕊总蛋白中提取；
(2)免疫小鼠
将抗原免疫6只Balb/c小鼠，监测其血清效价以决定最优的免疫次数，初次免疫后会经过3-4次的加强；
(3)血清检测和筛选
免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA检测血清滴度；
(4)融合及筛选
取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合，融合细胞铺到4块384孔板上进行培养，收集所有孔的上清，用ELISA对多肽检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养，生长几天后，收集所有孔的上清用ELISA检测与可溶片段检测原的反应，阳性孔进一步检测不同稀释度的可溶片段检测原结合；
(5)亚克隆及筛选
进行亚克隆得到单克隆杂交瘤细胞，细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部，ELISA检测每个孔上清针对可溶片段检测原和相应多肽检测原的反应，取OD值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆，重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备；
(6)抗体上清制和纯化
获得单克隆细胞株，通过腹部注射到免疫小鼠用于抗体生产，产生的腹水用ProteinA/G纯化，并用于后续检测。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于检测烟草多酚氧化酶的单克隆抗体，其特征在于；所述单克隆抗体用于抗体与抗原多肽的ELISA验证；
所述ELISA验证：
(1)取待配对腹水抗体包被96孔ELISA板，孵育，洗涤后脱脂牛奶过夜封闭，PBS洗涤，4℃保存待用；
(...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈穗云，廖菊够，马文广，牛永志，潘磊，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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