一种GAPDH纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种GAPDH纳米抗体及其应用，属于生物工程技术领域，GAPDH纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1～3中任一种所示。所述GAPDH纳米抗体对GAPDH蛋白的灵敏度为0.2223μg/ml～0.5625μg/ml。

A kind of GAPDH nano antibody and its application

【技术实现步骤摘要】
一种GAPDH纳米抗体及其应用
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种GAPDH纳米抗体及其应用。
技术介绍
骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体称单域抗体，单域抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又被称为纳米抗体。与传统的四联体抗体相比，单域抗体的主要特点有：分子量小，结构简单，理化性质稳定等。纳米抗体得优良特性使其在多种方面具有优势：在抗体进入机体方面纳米抗体能够穿过动物机体内的一些保护性的屏障进入发病部位发挥作用，如血脑屏障、血睾屏障等；在抗原抗体结合方面能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点，如GPCR、离子通道和酶活中心等；在降低生产成本方面纳米抗体结构简单易于体外表达，同时体外表达不易产生包涵体，生产工艺简单；同时纳米抗体的分子量小，结构简单，更有利于进行基因改造，纳米抗体人源化修饰等特性。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH或G3PDH)，是糖酵解反应中的一个酶。由于GAPDH广泛分布并高表达于各种组织中的细胞，且表达量稳定，因此，在分子生物学技术中GAPDH可作为管家基因(housekeepinggene)，被广泛用作实时定量PCR和Westernblot等实验中的内参。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种GAPDH纳米抗体及其应用，本专利技术提供的GAPDH纳米抗体对GAPDH蛋白的灵敏度为0.2223μg/ml～0.5625μg/ml。本专利技术提供的GAPDH纳米抗体可以成为Westernblot、免疫组织化学和免疫共沉淀(Co-IP)等相关技术的内参工具。同时，由于该抗体是纳米抗体，其分子量小，理化性质稳定，结构简单，能够穿过血脑屏障。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种GAPDH纳米抗体，所述GAPDH纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供了一种GAPDH纳米抗体，所述GAPDH纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术还提供了一种GAPDH纳米抗体，所述GAPDH纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。本专利技术还提供了上述技术方案所述的GAPDH纳米抗体在结合GAPDH蛋白中的应用。本专利技术还提供了上述技术方案所述的GAPDH纳米抗体在结合GAPDH蛋白中的应用。本专利技术还提供了上述技术方案所述的GAPDH纳米抗体在结合GAPDH蛋白中的应用。本专利技术提供了一种GAPDH纳米抗体及其应用，GAPDH纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1～3中任一种所示，这三种氨基酸序列具有纳米抗体恒定区，为ESGGGLVQPGGSLRLSCSFS……WFHQAPGKERE......YYADSVKGRFTISMDNSGNTVYLEMNNLEPEDTGIYYC......WGQGTQVTVSS(省略号部分为可变区)。所述GAPDH纳米抗体对GAPDH蛋白的灵敏度为0.2223μg/ml～0.5625μg/ml。附图说明图1为GAPDH纳米抗体纯化后用His标签检测结果；图2为GAPDH纳米抗体纯化后作为一抗用WesternBlotting法检B16黑素瘤细胞中的GAPDH。具体实施方式本专利技术提供了一种GAPDH纳米抗体，所述GAPDH纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，具体如下：ESGGGLVQPGGSLRLSCSFSGLSLDHTGIGWFHQAPGKEREAPPKDREGVSCISIKNYSYYADSVKGRFTISMDNSGNTVYLEMNNLEPEDTGIYYCATDTWRTPQGLCAMWSSFGSWGQGTQVTVSS。本专利技术提供了一种GAPDH纳米抗体，所述GAPDH纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，具体如下：ESGGGSVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSDINSGGSNSYYADFVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNNLKPGDTAVYHCNFGTYWGQGTQVTVSS。本专利技术提供了一种GAPDH纳米抗体，所述GAPDH纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，具体如下：ESGGGLVQPGGSLRLSCTASRNIFSIGHYAMGWYRQAPGKERELVATIYSDGDTYYQDSVKGRFTYSADTTSDTAYLQMSDLKPEDSGIYYCAPSPWGESDCLGVNDYEYWGQGTQVTVSS。在本专利技术中，所述GAPDH纳米抗体的筛选方法，优选包括以下步骤：1)将黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到B16-GAPDH-VHH1；所述第一轮淘洗的GAPDH蛋白的包被浓度为20μg/ml；2)将所述步骤1)得到的B16-GAPDH-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；所述第二轮淘洗的GAPDH蛋白的包被浓度为10μg/ml；所述第三轮淘洗的GAPDH蛋白的包被浓度为5μg/ml；所述第四轮淘洗的GAPDH蛋白的包被浓度为3μg/ml；3)将所述步骤2)得到的噬菌体溶液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；4)将所述步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同GAPDH蛋白的反应性，以确定所述菌株与GAPDH蛋白具有反应性；所述第一振荡的温度为35～42℃，所述第二振荡的温度为28～32℃；所述第一离心的离心力为7500～8500g，所述第二离心的离心力为2000～2100g；5)将所述步骤4)与GAPDH蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，具体如下：ctagctagcagttgcagctcgtggagtccg；所述质粒下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，具体如下：cgagctctggagctggggtcttcgc；6)将所述步骤5)得到的重组质粒、pBAD18转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，将所述蛋白进行SDS-PAGE鉴定和WesternBlotting鉴定，根据分子量大小和His-tag标签鉴定为GAPDH纳米抗体。本专利技术对所述黑素瘤纳米库没有特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种GAPDH纳米抗体，其特征在于，所述GAPDH纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种GAPDH纳米抗体，其特征在于，所述GAPDH纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.一种GAPDH纳米抗体，其特征在于，所述GAPDH纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。


3.一种GAPDH纳米抗体，其特征在于，所述GAPDH纳米抗体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：董常生，范瑞文，齐淑慧，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西;14