二甲双胍介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的纳米制剂和应用技术

本发明专利技术涉及一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的纳米制剂和应用，所述自组装方法是通过二甲双胍在纯水中以恒温退火、梯度退火以及慢退火等方式诱导核酸纳米材料自组装。所制备的二甲双胍/核酸复合纳米材料，细胞对其摄取的效率要高于传统方法制备的核酸纳米材料，在血清中具有更好的稳定性。采用该方法得到的携带Kras siRNA的二甲双胍/DNA折纸术纳米棒，是可用于协同治疗Kras基因突变肺癌的纳米制剂。该制剂具有更高效的siRNA递送效率，并与二甲双胍发挥协同抗肿瘤作用，在体内体外展现出更好的抗肿瘤效应，可用于制备治疗Kras基因突变肺癌的药物。

Metformin mediated self-assembly of nucleic acid nanomaterials and nanopreparations prepared by this method and its application

【技术实现步骤摘要】
二甲双胍介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的纳米制剂和应用
本专利技术涉及一种核酸介导纳米材料的自组装方法，尤其涉及一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法，特别涉及一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的携带siRNA的纳米制剂和应用。
技术介绍
开发通用药物载体是纳米医学研究中最重要的主题。既往已开发了多种药物递送载体，如：阳离子脂质体，环糊精材料，高分子聚合物材料，病毒衣壳等，但是这些有机材料有一定的免疫原性以及潜在毒性，因此医学实用性受到局限。近来新兴的DNA纳米技术为上述问题提供了很好的解决方法，DNA为人体内的天然组分，短链DNA无免疫原性和潜在毒性，且易于被生物降解，同时根据DNA碱基互补配对原则，DNA纳米材料可实现很好的可编程性，同时具有实现靶向性治疗的潜力。因此，自组装DNA纳米材料在疾病的基因治疗中有着巨大的应用前景。随着技术的发展，将DNA纳米材料应用于疾病的基因治疗也面临着新的挑战，传统的镁离子合成体系需要较高浓度的盐溶液体系，所含高浓度镁离子对特定条件下酶的活性有潜在伤害，并且维持纳米材料稳定性的体系与生理条件具有很大的差异。由于DNA纳米材料自身具有高负电性，细胞对于材料的摄取效率往往不够理想，这也在一定程度上限制了自组装核酸纳米材料的应用。因此以上问题亟待解决。胍基化合物是一类含有胍基基团的化合物，在生物体内广泛存在并且在生物医药中广泛应用。二甲双胍含有两个胍基，在生理条件下带两个单位的正电荷，因此具有介导DNA纳米材料自组装的潜力。二甲双胍介导的DNA自组装纳米材料稳定性更好；与镁离子相比，所带电荷数相近；但是镁离子的电荷排布是球型的，而二甲双胍的电荷排布是线性的，且分子量较大，分子的空间结构都比较大，因此可能附着DNA磷酸骨架的表面，在DNA纳米结构的表面覆盖一层二甲双胍分子。同时，DNA表面结合的二甲双胍可能遮盖磷酸二酯键，延缓酶对于其的作用，从而使得DNA双螺旋结构在血清中存在更长时间。二甲双胍介导的DNA自组装纳米材料无需额外的纳米递送系统，其本身由于质子化的氨基中和核酸的负电性，更易为细胞所摄取。二甲双胍不仅作为治疗Ⅱ型糖尿病的一线药物，而且研究证实其同时具有抗肿瘤的生物学效应，其所介导的DNA纳米管在不携带任何药物以及siRNA的情况，也存在杀伤肿瘤的效应，这是二甲双胍介导的DNA自组装纳米材料对于肿瘤协同治疗的基础。肺癌是发病率和死亡率增长最快，严重危害人类健康。非小细胞肺癌占比80％以上。近些年来肺癌的诊疗方面取得了一些进展，其中最为重要的就是对于不同基因突变靶点的靶向药物治疗，主要是使用一些酪氨酸激酶的抑制剂去靶向抑制突变基因的下游信号通路的持续激活，从而阻止癌细胞的恶性增殖。尽管如此，肺癌的五年生存率仍然只有16％左右，同时市面仍然没有针对对于Kras基因突变的靶向药物，往往Kras基因突变的患者其化疗效果也不是很理想。这是目前需要解决的问题，也是难题。RNA干扰技术自1998年Fire和Melo首次提出并证实以来，经过多年的发展与进步，于2018年全球首款的siRNA药物用于治疗多发性神经病由FDA批准上市，这为无靶向药物的肺癌治疗提供了参考和思考。小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，可高效、特异地抑制靶基因翻译过程，实现靶基因的表达下调。因此，如何设计开发临床适用的针对Kras基因突变肺癌治疗的siRNA递送系统仍然存在巨大的挑战。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法及采用该方法制备的携带siRNA的二甲双胍/DNA纳米棒制剂和应用，该方法可以在梯度退火、恒温退火以及慢退火条件下实现自组装，通过本专利技术发现，肺癌细胞对其摄取效率显著提高，与传统方法相比，该法制备的核酸纳米材料可以更稳定存在于生理体系中，并在血清中稳定存在的时间更长，同时该制剂中二甲双胍与siRNA发挥协同抗肿瘤作用。本专利技术的技术方案是提供：一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法，所述方法主要包含如下步骤：1)取合成纳米材料所需的DNA冻干粉，分别加水稀释，混匀，测浓度，得到DNA溶液；2)根据核酸组装所需的摩比取相应体的上述DNA溶液，在二甲双胍水溶液中以恒温退火、梯度退火以及慢退火等方式诱导核酸纳米材料的自组装合成；3)通过二甲双胍可介导DNA模块设计和DNA折纸术设计的自组装，获得所述二甲双胍介导核酸纳米材料自组装结构。根据上述的方法，步骤2)所述的恒温可以优选为22℃或37℃或45℃；步骤2)所述恒温合成为，在所述恒温条件放置30～90分钟；步骤2)所述梯度退火合成可以优选为，95℃放置5分钟，65℃放置30分钟，50℃放置30分钟，37℃放置30分钟，22℃放置30分钟；根据上述的方法，步骤2)所述的慢退火合成为，密封DNA溶液，放入100℃的水中缓慢降温，两天降至室温；根据上述的方法，步骤2)所述二甲双胍溶液的pH值可以为6.0-10.0；根据上述的方法，步骤2)所述二甲双胍水溶液的介导核酸纳米材料自组装的浓度范围5μM-1000μM；更有选的，浓度范围200μM-400μM。根据上述的方法，步骤3)二甲双胍介导的DNA模块的自组装方法通过二甲双胍介导由多条短于100碱基单链的DNA或RNA自组装DNA形成纳米结构，所述纳米结构包括但不限于DNA四面体和/或DNA纳米管；根据上述的方法，步骤3)二甲双胍介导的DNA折纸术自组装方法：二甲双胍介导利用折纸术设计的DNA结构自组装，包括但不限于DNA折纸术纳米棒和/或DNA折纸术四边形；根据本专利技术，采用上述方法制备的携带siRNA的DNA折纸术纳米棒的纳米制剂，所述的纳米材料由SEQIDNO.8所述序列骨架链p3024，SEQIDNO.9至SEQIDNO.80所述订书针链1～72、SEQIDNO.151所述KrassiRNA通过单链分子碱基互补配对合成，具体序列如表3与表4和表6所述。根据本专利技术所述的纳米制剂，所述的Scaffold与Staples的摩尔比优选为1:8，纳米棒、KrassiRNA的摩尔比优选为为1:6。上述的纳米制剂，可通过如下的制备方法获得，所述方法主要包含步骤：1)取订书针链1～72的冻干粉，分别加水稀释至100μM，取等体积混匀后得到订书针链预混液溶液；2)取骨架链p3024溶液和订书针链预混液按照1:2，1:4，1:6，1:8比例在二甲双胍溶液中混合，DNA以恒温退火或梯度退火或慢退火方式合成；将KrassiRNA添加到纳米材料溶液中，再次放置30分钟，得到携带KrassiRNA的纳米棒溶液。根据本专利技术所述制备的制剂，可用于制备治疗肺癌的药物中。由此，本专利技术也提供一种预防或治疗肺癌的制剂，其有效成分包含权利要求11-12任一所述的携带siRNA的DNA折纸术纳米棒，及医用辅料。与采用传统方法制备的核酸纳米材料相比，二甲双胍介导的纳米材料自组装本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法，其特征在于，所述方法包含：/n1)取合成纳米材料所需的DNA冻干粉，分别加水稀释，混匀，测浓度，得到DNA溶液；/n2)根据核酸组装所需的摩比取相应体的上述DNA溶液，在二甲双胍水溶液中以恒温退火、梯度退火以及慢退火方式诱导核酸纳米材料的自组装合成；/n3)通过二甲双胍可介导的DNA模块设计和DNA折纸术设计的自组装，获得所述二甲双胍介导核酸纳米材料自组装结构。/n

【技术特征摘要】
1.一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法，其特征在于，所述方法包含：
1)取合成纳米材料所需的DNA冻干粉，分别加水稀释，混匀，测浓度，得到DNA溶液；
2)根据核酸组装所需的摩比取相应体的上述DNA溶液，在二甲双胍水溶液中以恒温退火、梯度退火以及慢退火方式诱导核酸纳米材料的自组装合成；
3)通过二甲双胍可介导的DNA模块设计和DNA折纸术设计的自组装，获得所述二甲双胍介导核酸纳米材料自组装结构。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中：
所述的恒温为22℃或37℃或45℃，所述恒温合成为，在恒温条件放置30～90分钟；
所述梯度退火合成为，95℃放置5分钟，65℃放置30分钟，50℃放置30分钟，37℃放置30分钟，22℃放置30分钟；
所述慢退火合成为，密封DNA溶液，放入100℃的水中缓慢降温，两天降至室温。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤2)所述二甲双胍水溶液的pH值为6.0-10.0，并且所述二甲双胍水溶液的介导核酸纳米材料自组装的浓度范围5μM-1000μM。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述二甲双胍水溶液的介导核酸纳米材料自组装的浓度范围200μM-400μM。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中：
所述二甲双胍介导的DNA模块设计的自组装通过二甲双胍介导由多条短于100碱基单链的DNA或RNA自组装DNA形成纳米结构，所述纳米结构包括DNA四面体和/或DNA纳米管；
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【专利技术属性】
技术研发人员：钱航，王关嵩，王栋，徐智，贺斌峰，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50