一种检测弓形虫IgG抗体的酶联免疫试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测弓形虫IgG抗体的酶联免疫试剂盒及方法。本发明专利技术提供的检测弓形虫的间接酶联免疫试剂盒包括如下：抗原TgGRA54蛋白和包被液、或抗原TgGRA54蛋白溶液和包被液、或包被TgGRA54蛋白的酶标板；所述TgGRA54蛋白为如下a或b或c：a)序列表中序列2所示的蛋白质；b)序列表中序列2第35‑416位氨基酸所示的蛋白质；c)将a)或b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白质。本发明专利技术采用TgGRA54蛋白可用于临床上大批量弓形虫病的诊断，用其作为抗原制备间接酶联免疫试剂盒，其检测效果好，快速简便，特异性好。

A ELISA kit and method for the detection of IgG antibody of Toxoplasma gondii

【技术实现步骤摘要】
一种检测弓形虫IgG抗体的酶联免疫试剂盒及方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种检测弓形虫IgG抗体的酶联免疫试剂盒及方法。
技术介绍
弓形虫在世界范围内分布广泛，是一种属于顶复亚门孢子虫纲真球虫目的专性胞内原虫，引起的弓形虫病是危害人畜健康和经济发展的人兽共患病之一。弓形虫宿主种类十分广泛，几乎能感染所有的温血动物和部分冷血动物。我国饲养的动物和宠物中，都存在一定的感染率。其中，动物弓形虫感染中最常见的是猪，感染率为7.19％-75.95％，多数省份感染率在20％-40％，地区之间感染率差异较大。我国牛弓形虫感染率为0％-52.50％，山羊弓形虫感染率为1.4％-29.86％，可引起羊只流产或产弱羔及木乃伊胎。牛羊肉是中国人消费的主要肉品之一，因此，在牛和羊等牲畜的检疫工作中，准确的检疫和科学的处理可大大减少因弓形虫病造成的人畜健康问题和经济损失。弓形虫的感染没有明显的临床症状，仅依靠发病症状的诊断并不可靠。目前诊断弓形虫病的方法主要有病原学检测、分子生物学检测和血清学检测。病原学诊断方法涉及到对虫株的分离，试验周期长，不适合用于大批量临床样本的检测。分子生物学诊断方法一般依靠特定的核酸序列扩增和其它一些新兴的技术，费用昂贵，不适合在临床上推广。血清学诊断方法具有准确、便捷、快速等优点，目前是临床上常用的诊断方法。其中IFA一般认为是血清学诊断的金标准，ELISA方法相较于其它试验检测弓形虫IgG抗体的敏感性和特异性较高，而且易于商品化和自动化，适合弓形虫IgG抗体筛查，因此受到广泛关注。<br>
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测弓形虫的间接酶联免疫试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括如下：1)、抗原TgGRA54蛋白和包被液、或抗原TgGRA54蛋白溶液和包被液、或包被TgGRA54蛋白的酶标板；所述TgGRA54蛋白为如下a或b或c：a)序列表中序列2所示的蛋白质；b)序列表中序列2第35-416位氨基酸所示的蛋白质；c)将a)或b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白质。上述试剂盒中，所述抗原TgGRA54蛋白或所述抗原TgGRA54蛋白溶液的包被浓度为2.5μg/mL；或所述包被TgGRA54蛋白的酶标板中每孔TgGRA54蛋白含量为0.25μg。上述包被液为将抗原TgGRA54蛋白或抗原TgGRA54蛋白溶液稀释为2.5μg/mL的包被浓度的溶液，具体采用Tris-HCl缓冲液。上述试剂盒，还包括如下：2)封闭液：体积百分含量为5％的马血清溶液；3)用于稀释待测样品或血清标准品的稀释液；所述稀释液为封闭液；4)结合待测样品的酶标二抗，在本专利技术的实施例中具体为HRP标记兔抗牛IgG抗体；5)显色液；6)弓形虫阳性牛血清标准品和弓形虫阴性牛血清标准品；在本专利技术检测方法中，所述弓形虫阳性牛血清标准品和所述弓形虫阴性牛血清标准品的稀释倍数为1:200。上述试剂盒中，还包括7)记载判断标准的可读载体；所述判断标准如下：若待测样本OD450值≥0.306，则待测样本含有或候选含有弓形虫抗体，若待测样本OD450值小于0.306，则待测样本不含有或候选不含有弓形虫抗体；或，所述试剂盒还包括8)记载下述检测或辅助检测离体待测样品中是否含有弓形虫的方法的可读载体。本专利技术另一个目的是提供上述试剂盒的制备方法。本专利技术提供的方法，为将上述1)-6)或1-8)所述的物质分别单独包装。上述抗原TgGRA54蛋白在如下1)-6)中至少一种中的应用也是本专利技术保护的范围：1)制备检测或辅助检测待测样品中是否含有或感染弓形虫IgG抗体产品中的应用；2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或感染弓形虫IgG抗体产品中的应用；3)制备检测或辅助检测待测样品是否感染或含有弓形虫产品中的应用；4)检测或辅助检测待测样品是否感染或含有弓形虫产品中的应用；5)制备诊断或辅助诊断弓形虫病产品中的应用；6)诊断或辅助诊断弓形虫病产品中的应用。上述酶联免疫试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有或感染弓形虫IgG抗体产品中的应用；或，上述酶联免疫试剂盒中的1)-6)所述的物质在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有或感染弓形虫IgG抗体产品中的应用；或上述酶联免疫试剂盒中的1)-8)所述的物质在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有或感染弓形虫IgG抗体产品中的应用；本专利技术还提供检测或辅助检测离体待测样品中是否含有弓形虫的方法，是利用上述的酶联免疫试剂盒检测或辅助检测待测样品中是含有否弓形虫IgG抗体，或用TgGRA54蛋白作为抗原检测或辅助检测待测样品中是含有否弓形虫IgG抗体。上述方法包括如下步骤：1)包被：用Tris-HCl缓冲液将抗原TgGRA54蛋白溶液稀释至2.5μg/mL，按照每孔100μL加入酶标板中，包被；2)封闭：加入5％马血清溶液作为封闭液进行封闭；3)加待测样品：将待测样品的血清、弓形虫阳性牛血清标准品和弓形虫阴性牛血清标准品分别用封闭液进行1:200梯度稀释；反应；4)加酶标二抗：取结合待测样品的血清的酶标二抗(在本专利技术的实施例中具体为HRP标记兔抗牛IgG抗体)用封闭液1:10000稀释，加入酶标板孔孵育；5)显色：将底物显色液加入显色；6)终止：加入终止液；7)读数：在酶标仪上读出OD值；若待测样本OD450值≥0.306，则待测样本含有或候选含有IgG抗体，若待测样本OD450值小于0.306，则待测样本不含有或候选不含有IgG抗体。上述待测样品来源于牲畜或人或其他宠物，上述牲畜具体为牛或羊。本专利技术采用TgGRA54蛋白可用于临床上大批量弓形虫病的诊断，用其作为抗原制备间接酶联免疫试剂盒，其检测效果好，快速简便，特异性好。附图说明图1为TgGRA54目的基因单克隆PCR扩增结果；M：DNA分子质量标准；1：TgGRA54序列扩增结果。图2为TgGRA54-His目的蛋白表达情况；M：蛋白标准品；1：未诱导的菌液；2：经IPTG诱导的菌液；3：目的蛋白在上清的表达情况；4：目的蛋白在包涵体的表达情况。图3为TgGRA54-His目的蛋白上清纯化效果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，弓形虫阳性牛血清标准品为经间接免疫荧光抗体试验(抗原为弓形虫、一抗为血清，二抗为FITC标记兔抗牛IgG抗体(美国KPL公司产品))检测为强阳性的血清，且滴度为1：6400；弓形虫阴性牛血清标准品为间接免疫荧光抗体试验(抗原为弓形虫、一抗为血清，二抗为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测弓形虫的间接酶联免疫试剂盒，包括如下：/n1)、抗原TgGRA54蛋白和包被液、或抗原TgGRA54蛋白溶液和包被液、或包被TgGRA54蛋白的酶标板；/n所述TgGRA54蛋白为如下a或b或c：/na)序列表中序列2所示的蛋白质；/nb)序列表中序列2第35-416位氨基酸所示的蛋白质；/nc)将a)或b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测弓形虫的间接酶联免疫试剂盒，包括如下：
1)、抗原TgGRA54蛋白和包被液、或抗原TgGRA54蛋白溶液和包被液、或包被TgGRA54蛋白的酶标板；
所述TgGRA54蛋白为如下a或b或c：
a)序列表中序列2所示的蛋白质；
b)序列表中序列2第35-416位氨基酸所示的蛋白质；
c)将a)或b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白质。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述抗原TgGRA54蛋白或所述抗原TgGRA54蛋白溶液的包被浓度为2.5μg/mL；
或所述包被TgGRA54蛋白的酶标板中每孔TgGRA54蛋白含量为0.25μg。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述包被液为Tris-HCl缓冲液。


4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下：
2)封闭液：体积百分含量为5％的马血清溶液；
3)用于稀释待测样品的血清或血清标准品的稀释液；所述稀释液为封闭液；
4)结合待测样品的酶标二抗；
5)显色液；
6)弓形虫阳性牛血清标准品和弓形虫阴性牛血清标准品。


5.根据权利要求1-4中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括7)记载判断标准的可读载体；
所述判断标准如下：若待测样本OD450值≥0.306，则待测样本含有或候选含有弓形虫抗体，若待测样本OD450值小于0.306，则待测样本不含有或候选不含有弓形虫抗体；
或，所述试剂盒还包括8)记载如下权利要求10的方法的可读载体。


6.权利要求1-5中任一所述的酶联免疫试剂盒的制备方法，为将权利要求4或5中的1)-6)或1-7)所述的物质分别单独包装。


7.权利要求1中的抗原TgGRA54蛋白在如下1)-6)中至少一种中的应用：
1)制备检测或辅助检测待测样品中是否含有或感...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晶，凌慧芳，王先梅，刘群，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11