一种基于色素和酸释放响应的微生物检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于色素和酸释放响应的微生物检测方法及其应用，检测方法包括，先用氧化锌颗粒堵住负载有姜黄素的介孔材料的孔得到氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体，再将氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体与目标微生物结合得到目标微生物‑姜黄素@介孔材料复合体，然后利用醋酸溶解目标微生物‑姜黄素@介孔材料复合体中的氧化锌，将颜色和荧光信号释放并计算得到目标微生物的浓度。本发明专利技术所提供的基于色素和醋酸释放的无酶微生物检测方法能有效提高检测稳定性和灵敏度，降低检测成本；具有较好的检测特异性，采用生物识别元件特异性分离目标微生物，可以减少样本背景中其它分子等杂质的干扰影响，应用前景好。

A microbial detection method based on the response of pigment and acid release and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于色素和酸释放响应的微生物检测方法及其应用
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种基于色素和酸释放响应的微生物检测方法及其应用。
技术介绍
近年来食品安全事件时有发生，不仅造成了巨大的经济损失，而且严重威胁了公共卫生安全；其中，病原微生物是引起食物中毒的主要风险因子，引起的食品安全事件由于具有危害大、预防控制困难等特点，日益受到人们的关注，而病原微生物的快速筛查是预防和控制此类食品安全事件的关键。光学生物传感器由于具有非接触性和检测速度快等优点，已被广泛应用于病原微生物检测。传统比色光学生物传感器的检测方法大多数是基于酶对底物进行催化，引起底物颜色变化，通过底物颜色测定目标微生物含量；然而，该方法主要存在以下两方面缺陷：(1)酶属于比较昂贵的生物材料，且酶的本质是蛋白质，对环境要求较高，当温度较高(超过40℃)或不适pH值时，酶就会失去活性，从而限制了其实际应用；(2)由底物所引起的颜色变化通常不稳定，易受时间和温度影响，造成信号不稳定，从而降低了系统检测的灵敏度。姜黄素是一种具有二酮的色素，为二酮类化合物，其不溶于水，溶于乙醇和丙二醇，易溶于冰醋酸和碱溶液；具体地，姜黄素在碱性时呈褐色，在中性和酸性时呈黄色，且姜黄素的稳定性较强，着色性强。目前为止，尚未见到有关姜黄素在微生物检测方法上的应用的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何提高检测微生物的灵敏度、降低检测成本和提高检测稳定性。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于色素和酸释放响应的微生物检测方法，包括：先用氧化锌颗粒堵住负载有姜黄素的介孔材料的孔，得到氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体，再将所述氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体与目标微生物结合，得到目标微生物-姜黄素@介孔材料复合体，然后利用醋酸溶解所述目标微生物-姜黄素@介孔材料复合体中的氧化锌，将颜色和荧光信号释放，通过检测颜色变化和荧光强度得到姜黄素的浓度，进而计算得到目标微生物的浓度。在上述技术方案中，所述微生物检测方法具体包括以下步骤：S1、利用目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁珠对所述目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的和富集的磁珠-目标微生物复合体；S2、利用负载了氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体并修饰了所述目标微生物的第二生物识别元件的免疫复合材料与所述磁珠-目标微生物复合体进行结合，形成磁珠-目标微生物-姜黄素@复合材料复合体；S3、利用醋酸溶液重悬所述磁珠-目标微生物-姜黄素@复合材料复合体，醋酸溶解氧化锌的同时释放出姜黄素，使溶液颜色变化并具有荧光信号；S4、通过检测颜色变化和荧光强度双重信号，得到所述姜黄素的浓度，进而计算得到目标微生物的浓度。具体地，在上述技术方案中，步骤S2具体包括：S21、将姜黄素溶解在80％(v/v)乙醇中，以质量比1：2比例与介孔材料混合，超声后室温搅拌，离心后清洗得到负载了姜黄素的介孔材料；S22、将负载了姜黄素的介孔材料溶入水中，加入修饰有氨基的氧化锌颗粒，混合后室温反应，随后离心并清洗得到氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体；S23、利用点击化学反应四嗪和反式环辛烯，将所述目标微生物的第二生物识别元件与氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体结合，形成免疫姜黄素@介孔材料。优选地，在上述技术方案中，所述第二生物识别元件为多克隆抗体。详细地，在上述技术方案中，步骤S23具体包括：S231、用二甲基甲酰胺为溶剂，溶解四嗪和反式环辛烯的浓度分别为10mM；S232、将四嗪与多克隆抗体以摩尔比1：40混合，室温反应45min后，用10kD超滤管离心过滤，以10000rpm的转速在4℃温度下离心20min，并用超纯水清洗3次，去除多余四嗪，得到四嗪-多克隆抗体，类似地，在氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔复合体上标记反式环辛烯，得到反式环辛烯-氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔复合体；S233、将四嗪-多克隆抗体和反式环辛烯-氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔复合体混合反应45min，离心清洗后得到免疫姜黄素@介孔材料。具体地，在上述技术方案中，步骤S1具体包括：S11、利用生物素、所述第一生物识别元件和链霉亲和素化的磁珠制备所述免疫磁珠，将所述免疫磁珠溶解于磷酸盐缓冲液，优选地，所述第一生物识别元件为单克隆抗体；S12、将所述免疫磁珠与含有所述目标微生物的样本溶液进行混合孵育，所述免疫磁珠捕获所述目标微生物，形成所述磁珠-目标微生物复合体；S13、利用磁场从所述免疫磁珠与所述样本溶液形成的混合溶液中分离并富集所述磁珠-目标微生物复合体。优选地，在上述技术方案中，所述第一生物识别元件为单克隆抗体。具体地，在上述技术方案中，步骤S3具体包括：S31、利用磁场捕获所述磁珠-目标微生物-姜黄素@复合材料复合体并除去上清液，随后用醋酸溶液溶解所述磁珠-目标微生物-姜黄素@复合材料复合体；S32、利用所述醋酸溶液溶解氧化锌颗粒，释放出介孔材料上负载的姜黄素，并使姜黄素溶解在醋酸中，利用磁场捕获所述磁珠-目标微生物-复合材料复合体并分离得到上清液。具体地，在上述技术方案中，步骤S4中，分别采用酶标仪和光谱仪检测颜色变化和荧光强度，计算得到目标微生物的浓度。进一步地，在上述技术方案中，所述目标微生物识别材料和所述抗体与所述目标微生物的结合位点不同。详细地，在上述技术方案中，所述目标物识别材料是可以特异性识别目标物并可与之结合的生物材料，包括抗体，噬菌体、适配体等。详细地，在上述技术方案中，所述免疫磁珠上修饰的抗体和所述免疫姜黄素@介孔材料上修饰的抗体与目标微生物的结合位点不同，是两个配对的抗体。在本专利技术的具体实施方式中，所述姜黄素还可以用其他色素、染料或者荧光素等代替。本专利技术另一方面还提供了上述微生物检测方法在光学生物传感器中的应用。详细地，上述微生物检测方法的颜色变化和荧光强度的信号比较稳定，能提高检测的稳定性，且检测成本低。本专利技术的优点：(1)本专利技术提供了一种基于色素和醋酸释放的无酶微生物检测方法，利用本专利技术的方法提高了检测稳定性和灵敏度，降低了成本；(2)本专利技术利用介孔材料负载姜黄素并利用氧化锌颗粒堵孔，利用醋酸溶解氧化锌释放姜黄素，且姜黄素在醋酸中易溶，并呈现出颜色和荧光双信号，有效地放大了检测信号，并提高了稳定性和准确度；(3)本专利技术方法是无酶的反应，降低了成本，提高了实际应用的可能；(4)本专利技术通过生物识别元件修饰的免疫磁珠分离并富集目标微生物，提高了目标微生物的浓度；(5)利用本专利技术的方法可在2h内得到极少量微生物的定量检测结果；(6)利用本专利技术的方法具有较好的检测特异性，采用抗体等生物识别元件特异性分离目标微生物，可以减少样本背景中其它分子等杂质的干扰影响。附图说明图1为本专利技术实施例的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于色素和酸释放响应的微生物检测方法，其特征在于，包括：/n先用氧化锌颗粒堵住负载有姜黄素的介孔材料的孔，得到氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体，再将所述氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体与目标微生物结合，得到目标微生物-姜黄素@介孔材料复合体，然后利用醋酸溶解所述目标微生物-姜黄素@介孔材料复合体中的氧化锌，将颜色和荧光信号释放，通过检测颜色变化和荧光强度得到姜黄素的浓度，进而计算得到目标微生物的浓度。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于色素和酸释放响应的微生物检测方法，其特征在于，包括：
先用氧化锌颗粒堵住负载有姜黄素的介孔材料的孔，得到氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体，再将所述氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体与目标微生物结合，得到目标微生物-姜黄素@介孔材料复合体，然后利用醋酸溶解所述目标微生物-姜黄素@介孔材料复合体中的氧化锌，将颜色和荧光信号释放，通过检测颜色变化和荧光强度得到姜黄素的浓度，进而计算得到目标微生物的浓度。


2.根据权利要求1所述的微生物检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、利用目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁珠对所述目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的和富集的磁珠-目标微生物复合体；
S2、利用负载了氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体并修饰了所述目标微生物的第二生物识别元件的免疫复合材料与所述磁珠-目标微生物复合体进行结合，形成磁珠-目标微生物-姜黄素@复合材料复合体；
S3、利用醋酸溶液重悬所述磁珠-目标微生物-姜黄素@复合材料复合体，醋酸溶解氧化锌的同时释放出姜黄素，使溶液颜色变化并具有荧光信号；
S4、通过检测颜色变化和荧光强度双重信号，得到所述姜黄素的浓度，进而计算得到目标微生物的浓度。


3.根据权利要求2所述的微生物检测方法，其特征在于，步骤S2具体包括：
S21、将姜黄素溶解在80v/v％乙醇中，以质量比1：2比例与介孔材料混合，超声后室温搅拌，离心后清洗得到负载了姜黄素的介孔材料；
S22、将负载了姜黄素的介孔材料溶入水中，加入修饰有氨基的氧化锌颗粒，混合后室温反应，随后离心并清洗得到氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体；
S23、利用点击化学反应四嗪和反式环辛烯，将所述目标微生物的第二生物识别元件与氧化锌堵孔后的姜黄素@介孔材料复合体结合，形成免疫姜黄素@介孔材料，优选地，所述第二生物识别元件为多克隆抗体。


4.根据权利要求3所述的微生物检测方法，其特征在于，步骤S23具体包括：
S231、用二甲基甲酰胺为溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建涵，薛丽，黄凤春，郭儒雅，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11