一种微生物快速定性定量的试剂盒以及快速定性定量的方法技术

本发明专利技术公开了一种微生物的快速定性定量的检测试剂盒以及快速定性定量的方法，属于微生物定性定量分析技术领域。本发明专利技术采用蛋白A和抗体B与待测微生物特异性结合形成复合物，蛋白A连接有磁珠，通过磁架分离复合物；向复合物中加入HRP标记的二抗，可以实现待测微生物的可视化检测；对于可视化检测阳性的样品进行RT‑PCR扩增进行定量分析。本发明专利技术试剂盒具有操作简便，无需对待测样本进行复杂的前处理；检测成本低，对检测仪器的要求低，结果可肉眼观察，特别适用于基层及偏远地区使用。当本发明专利技术用于微生物检测时，免去了样品前处理及靶标提纯，同时实现RT‑PCR扩增，有利于实现对微生物的定性和定量分析。

A rapid qualitative and quantitative kit for microorganisms and a rapid qualitative and quantitative method

【技术实现步骤摘要】
一种微生物快速定性定量的试剂盒以及快速定性定量的方法
本专利技术属于微生物定性定量分析
，具体涉及一种微生物的快速定性定量的检测试剂盒以及快速定性定量的方法。
技术介绍
目前用于微生物检测的方法，主要有传统的基于微生物培养的生化检验技术、分子生物学技术和免疫学检测方法等。传统的微生物培养检验技术要经过培养、分离纯化、生化鉴定等步骤，存在操作繁琐耗时(3-7天)、检测灵敏度低、分析目标受限和容易出现假阳性结果等缺点，在应对突发性公共安全事件上，不能满足快速、准确、灵敏和特异性高等要求。随着分子生物学的快速发展，对微生物的检测鉴定已不再局限于对其外部形态及生理特性等常规检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，由此衍生出了很多的分子检测技术，如DNA探针技术、聚合酶链式反应技术(PCR)、基因芯片技术等。尽管这些技术被广泛的用于微生物的检测，但无法达到直接检测微生物的目的，而且需要昂贵的高精密仪器支持与细胞裂解、DNA提取、扩增纯化等繁琐的样品处理过程，且无法区分微生物的生存形态。免疫学检测方法的基本原理是抗原抗体的免疫反应，不同的微生物有其特异的抗原，并能激发机体产生相应的特异性抗体，因此免疫学检测技术能够直接用于检测致病微生物。然而，抗体的生产成本高，易失活并容易发生交叉污染，严重限制了免疫学检测方法在实际中的应用。无论是食品工业生产流程的检测和质控，还是政府部门对食品安全的监管，都迫切需要更加快速、灵敏、简单的食源性致病微生物检测方法。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种微生物的快速定性定量的试剂盒以及快速定性定量的方法，以解决现有检测微生物技术中存在的灵敏度低、检测方法繁琐、仪器设备要求高等问题。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种微生物快速定性定量的试剂盒，包含定量反应体系和定性反应体系；所述定性反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、HRP-二抗、洗脱液；定量反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、洗脱液、RNA提取试剂、聚合酶、反转录酶、扩增缓冲液、dNTPs、扩增引物；所述蛋白A为微生物靶向人体细胞的受体蛋白；所述抗体B为特异性识别结合微生物表面外壳蛋白的IgG抗体；所述蛋白A和抗体B可与待检测微生物特异性结合形成三元复合体。在上述方案的基础上，所述的蛋白A磁珠由以下方法制备而成：称取200mg蛋白A，169.31mgEDC和47.98mgNHSS，分别溶于无菌的PBS溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化蛋白A，活化10min；将活化后的蛋白A加入到牛血清白蛋白修饰的磁珠中，孵育6h；反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，即得浓度为20mg/mL的蛋白A包裹磁珠。在上述方案的基础上，所述的磁珠为四氧化三铁磁珠。在上述方案的基础上，所述微生物为食源性致病菌、冠状病毒、流感病毒、乙肝病毒中的任意一种。在上述方案的基础上，所述微生物快速定性定量的试剂盒的使用方法为：(1)向待测溶液中加入蛋白A-磁珠和抗体B，混合孵育，使抗体B和磁珠上的蛋白A特异性结合在待检微生物上；分离蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物；(2)蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物中加入特异性识别结合抗体B的HRP-二抗，再加入HRP的催化底物，通过观察颜色变化，实现微生物的定性检测；(3)将步骤2)定性检测阳性的蛋白A-磁珠/微生物/抗体B复合物进行RT-PCR扩增，对微生物进行定量分析。一种微生物快速定性定量的方法，步骤如下：(1)向待测溶液中加入蛋白A-磁珠和抗体B，混合孵育，使抗体B和磁珠上的蛋白A特异性结合在待微生物上；分离蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物；(2)蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物中加入特异性识别结合抗体B的HRP-二抗，再加入HRP的催化底物，通过观察颜色变化，实现微生物的定性检测；(3)将步骤2)定性检测阳性的蛋白A-磁珠/微生物/抗体B复合物进行RT-PCR扩增，对微生物进行定量分析。在上述方案的基础上，所述蛋白A为微生物靶向人体细胞的受体蛋白；所述抗体B为特异性识别结合微生物表面外壳蛋白的IgG抗体。在上述方案的基础上，所述的蛋白A磁珠由以下方法制备而成：称取200mg蛋白A，169.31mgEDC和47.98mgNHSS，分别溶于无菌的PBS溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化蛋白A，活化10min；将活化后的蛋白A加入到牛血清白蛋白修饰的磁珠中，孵育6h；反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，即得浓度为20mg/mL的蛋白A包裹磁珠。在上述方案的基础上，所述的磁珠为四氧化三铁磁珠。在上述方案的基础上，所述微生物为食源性致病菌、冠状病毒、流感病毒、乙肝病毒中的任意一种。本专利技术技术方案的优点本专利技术试剂盒具有操作简便，无需对待测样本进行复杂的前处理；检测成本低，对检测仪器的要求低，结果可肉眼观察，特别适用于基层及偏远地区使用。特别的，当本专利技术用于微生物检测时，免去了样品前处理及靶标提纯，但同时实现RT-PCR扩增，有利于实现对微生物的定性和定量分析。附图说明图1可视化快速检测微生物示意图；图2快速磁珠分离联合PCR检测微生物示意图；图3检测操作步骤示意图。具体实施方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本专利技术。以下实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。RT-PCR即逆转录PCR的扩增技术，是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。本专利技术试剂盒中的洗脱液可以为磷酸缓冲盐液等常用洗脱溶液；HRP-二抗为能够特异性识别抗体B的HRP标记的抗体；本专利技术试剂盒中的RNA提取试剂为本领域常用RNA提取试剂；扩增缓冲液为普通PCR扩增缓冲液。本专利技术的试剂盒在进行定量分析时，可采用qPCR的方式对待测微生物进行准确定量，扩增引物包含荧光定量PCR的正向和反向引物以及探针引物。本专利技术试剂盒的检测原理本专利技术利用两种蛋白质识别靶标微生物，一种是微生物的受体蛋白A、一种是微生物的抗体B，均可作用于微生物。受体蛋白A与磁珠偶联可用于纯化分离微生物，抗体B识别元件结合微生物，并且作为HRP-二抗的结合位点引入HRP，可将信号进行转化和放大。本专利技术利用两种方法来检测微生物，一种是利用引入的HRP催化底物实现可视化检测，另一种是对蛋白A-磁本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微生物快速定性定量的试剂盒，其特征在于，包含定量反应体系和定性反应体系；所述定性反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、HRP-二抗、洗脱液；/n定量反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、洗脱液、RNA提取试剂、聚合酶、反转录酶、扩增缓冲液、dNTPs、扩增引物；/n所述蛋白A为微生物靶向人体细胞的受体蛋白；/n所述抗体B为特异性识别结合微生物表面外壳蛋白的IgG抗体；/n所述蛋白A和抗体B可与待检测微生物特异性结合形成三元复合体。/n

【技术特征摘要】
1.一种微生物快速定性定量的试剂盒，其特征在于，包含定量反应体系和定性反应体系；所述定性反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、HRP-二抗、洗脱液；
定量反应体系包含蛋白A磁珠、抗体B、磁架、洗脱液、RNA提取试剂、聚合酶、反转录酶、扩增缓冲液、dNTPs、扩增引物；
所述蛋白A为微生物靶向人体细胞的受体蛋白；
所述抗体B为特异性识别结合微生物表面外壳蛋白的IgG抗体；
所述蛋白A和抗体B可与待检测微生物特异性结合形成三元复合体。


2.根据权利要求1所述微生物快速定性定量的试剂盒，其特征在于，所述的蛋白A磁珠由以下方法制备而成：
称取200mg蛋白A，169.31mgEDC和47.98mgNHSS，分别溶于无菌的PBS溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化蛋白A，活化10min；将活化后的蛋白A加入到牛血清白蛋白修饰的磁珠中，孵育6h；反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，即得浓度为20mg/mL的蛋白A包裹磁珠。


3.权利要求2所述微生物快速定性定量的试剂盒，其特征在于，所述的磁珠为四氧化三铁磁珠。


4.根据权利要求1～3任一项所述微生物快速定性定量的试剂盒，其特征在于，所述微生物为食源性致病菌、冠状病毒、流感病毒、乙肝病毒中的任意一种。


5.根据权利要求1～3任一项所述微生物快速定性定量的试剂盒，其特征在于，使用方法为：
(1)向待测溶液中加入蛋白A-磁珠和抗体B，混合孵育，使抗体B和磁珠上的蛋白A特异性结合在待微生物上；分离蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物；
(2)蛋白A-磁珠/微生物/抗体B的复合物中加入特异性识别结合抗体B的HRP-二抗，再加入HRP的催化底物，通过观察颜...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴薇，杨庆利，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37