一种Art V1重组蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种Art V1重组蛋白及其制备方法和应用，所述Art V1重组蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。所述Art V1重组蛋白的编码基因经过密码子优化，经人工合成后亚克隆至真核载体得到重组载体，采用真核表达系统表达制备，有利于实现Art V1重组蛋白在真核表达系统中的高效表达。

A recombinant art V1 protein and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种ArtV1重组蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种ArtV1重组蛋白及其制备方法和应用，尤其涉及一种艾蒿主要组分过敏原ArtV1重组蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
近年来，随着人们生活方式的改变以及工作压力的增加，过敏性疾病的发病率逐年增高，已经成为影响人们生活质量的重要疾病之一。全球范围内每年约有3亿人患过敏性支气管哮喘，5亿人患过敏性鼻炎，3-5亿人发生食物过敏。过敏性疾病严重影响身心健康，因此，对过敏性疾病的诊断和预防尤其重要。艾蒿是一种造成I型过敏反应的重要过敏原，可以引起过敏性鼻炎和哮喘等症状，其主要含有ArtV1、ArtV2、ArtV3和ArtV4四种致敏组分过敏原，其中最主要的组分过敏原为ArtV1。ArtV1是一种含有两个IgE抗体识别区的分泌蛋白，重组表达ArtV1在艾蒿过敏诊断和脱敏治疗中具有广泛的应用前景。CN106729698A公开了NY-ESO-1有作为增强Artv1(wtArt)过敏原免疫反应分子佐剂的作用，但是没有公开如何获得Artv1过敏原。因此，研究一种经济、有效的制备ArtV1组分过敏原的方法在过敏性疾病诊断和治疗领域具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种ArtV1重组蛋白及其制备方法和应用，所述ArtV1重组蛋白的编码基因经过密码子优化，采用真核表达系统表达制备，产量高、成本低，具有广阔的应用前景。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种编码ArtV1重组蛋白的核酸分子，所述核酸分子包括如SEQIDNO:1所示的核酸序列；SEQIDNO:1：ATGACCAGACTGACCGTGCTGGCCCTGCTGGCCGGCCTGCTGGCCAGCAGCAGAGCCGCCGGCAGCAAGCTGTGCGAGAAGACCAGCAAGACCTACAGCGGCAAGTGCGACAACAAGAAGTGCGACAAGAAGTGCATCGAGTGGGAGAAGGCCCAGCACGGCGCCTGCCACAAGAGAGAGGCCGGCAAGGAGAGCTGCTTCTGCTACTTCGACTGCAGCAAGAGCCCCCCCGGCGCCACCCCCGCCCCCCCCGGCGCCGCCCCCCCCCCCGCCGCCGGCGGCAGCCCCAGCCCCCCCGCCGACGGCGGCAGCCCCCCCCCCCCCGCCGACGGCGGCAGCCCCCCCGTGGACGGCGGCAGCCCCCCCCCCCCCAGCACCCAC。本专利技术中，根据艾蒿主要组分过敏原ArtV1的mRNA序列，将ArtV1基因的原信号肽替换为Azurocidinpreproprotein信号肽序列，并进行密码子优化，密码子优化主要通过调整GC含量，mRNA二级结构等，利用在线密码子优化工具(https://www.vectorbuilder.cn/tool/codon-optimization.html)，得到适用于真核表达系统的编码ArtV1重组蛋白的核酸分子，所述核酸分子经人工合成后亚克隆至真核载体得到重组载体，有利于实现ArtV1重组蛋白在真核表达系统中的高效表达。第二方面，本专利技术提供了一种重组载体，所述重组载体包括如第一方面所述的核酸分子。本专利技术中，重组载体具有多克隆位点，是一种可以调控外源基因表达的分子生物学载体。优选地，所述重组载体的空载体包括pcDNA3.1/myc-HisA。第三方面，本专利技术提供了一种真核表达系统，所述真核表达系统转染有如第一方面所述的核酸分子和/或如第二方面所述的重组载体。优选地，所述真核表达系统包括可以表达外源基因的真核细胞。优选地，所述真核细胞包括哺乳细胞。优选地，所述哺乳细胞包括HEK293F细胞。第四方面，本专利技术提供了一种ArtV1重组蛋白，所述ArtV1重组蛋白采用如第三方面所述的真核表达系统进行表达。优选地，所述ArtV1重组蛋白包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；SEQIDNO:2：AGSKLCEKTSKTYSGKCDNKKCDKKCIEWEKAQHGACHKREAGKESCFCYFDCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGSPSPPADGGSPPPPADGGSPPVDGGSPPPPSTH。第五方面，本专利技术提供了一种如第四方面所述的ArtV1重组蛋白的制备方法，所述方法包括：(1)将编码ArtV1重组蛋白的核酸分子插入真核载体，得到重组载体；(2)将所述重组载体转化入真核表达系统，诱导培养；(3)收集所述真核表达系统的培养上清，纯化后得到所述ArtV1重组蛋白。优选地，步骤(1)所述核酸分子如SEQIDNO:1所示。优选地，步骤(1)所述真核载体包括pcDNA3.1/myc-HisA。优选地，步骤(1)所述核酸分子插入真核载体的HindIII和XbaI限制性酶切位点。优选地，步骤(2)所述真核表达系统包括真核细胞。优选地，所述真核细胞包括哺乳细胞。优选地，所述哺乳细胞包括HEK293F细胞。优选地，步骤(2)所述转化的方法包括化学转染和/或物理转染。优选地，步骤(3)所述纯化的方法包括亲和层析。优选地，所述亲和层析采用镍柱进行。作为优选技术方案，本专利技术提供了一种如第四方面所述的ArtV1重组蛋白的制备方法，所述方法包括：(1)将编码ArtV1重组蛋白的核酸分子SEQIDNO:1插入真核载体pcDNA3.1/myc-HisA的HindIII和XbaI限制性酶切位点，得到重组载体；(2)将所述重组载体转化入HEK293F细胞，诱导培养；(3)收集HEK293F细胞的培养上清，采用镍柱亲和层析后得到所述ArtV1重组蛋白。第六方面，本专利技术提供了一种如第一方面所述的核酸分子、如第二方面所述的重组载体、如第三方面所述的真核表达系统或如第四方面所述的ArtV1重组蛋白在制备过敏性疾病诊断试剂和/或治疗药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术将ArtV1基因的原信号肽替换为Azurocidinpreproprotein信号肽序列，并进行密码子优化，得到适用于真核表达系统的编码ArtV1重组蛋白的核酸分子；(2)本专利技术将所述核酸分子经人工合成后亚克隆至真核载体得到重组载体，转染至真核表达系统中，实现了ArtV1重组蛋白的高效表达，1L诱导表达量可获得10.5mg艾蒿ArtV1重组蛋白，并且艾蒿ArtV1重组蛋白的纯度高达90％以上；(3)本专利技术的制备方法操作简单、成本低、产量高，在过敏性疾病诊断和治疗领域具有广阔的应用前景。附图说明图1为ArtV1重组蛋白的SDS-PAGE图，其中，泳道1为纯化前样品，泳道2为洗涤收集液，泳道3为洗脱收集液，泳道4为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码Art V1重组蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括如SEQ IDNO:1所示的核酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种编码ArtV1重组蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括如SEQIDNO:1所示的核酸序列。


2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括如权利要求1所述的核酸分子；
优选地，所述重组载体的空载体包括pcDNA3.1/myc-HisA。


3.一种真核表达系统，其特征在于，所述真核表达系统转染有如权利要求1所述的核酸分子和/或如权利要求2所述的重组载体；
优选地，所述真核表达系统包括真核细胞；
优选地，所述真核细胞包括哺乳细胞；
优选地，所述哺乳细胞包括HEK293F细胞。


4.一种ArtV1重组蛋白，其特征在于，所述ArtV1重组蛋白采用如权利要求3所述的真核表达系统进行表达；
优选地，所述ArtV1重组蛋白包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。


5.一种如权利要求4所述的ArtV1重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将编码ArtV1重组蛋白的核酸分子插入真核载体，得到重组载体；
(2)将所述重组载体转化入真核表达系统，诱导培养；
(3)收集所述真核表达系统的培养上清，纯化后得到所述ArtV1重组蛋白。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述核酸分子如SEQIDNO:1所示；
优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：李子樵，周延庆，
申请(专利权)人：蓝怡科技集团股份有限公司，浙江蓝怡医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31