一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统技术方案

本发明专利技术公开了一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统，包括按照光路依次设置的光源模块、横向视场扩展模块、扫描模块、照明模块和探测模块，光源模块产生的光经过横向视场扩展模块以获得扩展最终照明区域的有效视场，扫描模块将从横向视场扩展模块接收的线光束扫描成为面光束，照明模块和探测模块采用分束镜、照明单元、第一照明物镜和第二照明物镜使得透射的红外光携带斑马鱼样品的结构信息进入探测模块，探测模块采用红外相机和互补金属氧化物半导体相机分别实现近红外光和荧光探测成像。本发明专利技术不会对样本产生影响的，具有高横向和轴向分辨率和高成像速度。

A high resolution optical micro imaging system for the observation of free-moving zebrafish

【技术实现步骤摘要】
一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统
本专利技术光学显微成像
，具体涉及一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统。
技术介绍
斑马鱼是一种模式生物，与人类基因组同源性高(利于建立疾病模型)，因此是生物医学研究中常用的样本。由于其幼体通体透明，适合由光学显微成像系统进行成像研究。常规的对斑马鱼进行活体成像系统，在观察时将斑马鱼固定在琼脂糖凝胶中，防止其活动对成像的影响。主要原因是常规的成像方式下，分辨率和成像视场相互制约，获取高分辨率图像时，成像视场往往较小，需要将样本严格固定在视场范围内。然而这种将样品限制不动的成像方式在神经成像时，会影响其行动决策，无法获取对应的神经信息，不利于对其进行完善的研究。目前用于自由活动斑马鱼成像的系统少有研究，文章(Kim,D.H.etal.Pan-neuronalcalciumimagingwithcellularresolutioninfreelyswimmingzebrafish.Nat.Methods14,1107–1114(2017).)采用一个二维电动平移台，在平移台上固定放有斑马鱼的样品池，斑马鱼可在样品池内自由活动，当其出动作时，二维平移台根据捕捉的图像及时抵消其运动，使得斑马鱼始终处于成像视场内，实现对自由活动的斑马鱼进行高速三维神经成像，其成像视场为1001×761μm。文章(Cong,L.etal.Rapidwholebrainimagingofneuralactivityinfreelybehavinglarvalzebrafish(Daniorerio).Elife6,1–20(2017).)采用了类似的方法实现自由活动斑马鱼的成像。上述方法均基于运动补偿的方式实现对自由活动样品的成像，使得样本始终位于成像视场中。主要原因是它们的成像视场有限，无法对样本的整个活动区域成像，这种方式的缺点是动物样本会受到平台运动对其产生的作用力，从而影响其神经活动，并非真正意义上的的自由运动，并且当动物运动较快时，运动补偿机制容易产生误差，使得神经信号没有被捕捉到。针对这些问题，文章(Symvoulidis,P.etal.NeuBtracker-Imagingneurobehavioraldynamicsinfreelybehavingfish.Nat.Methods14,1079–1082(2017).)使用一个大视场物镜，进行样本活动区域的全面成像，这种方式下成像不会对样本产生干扰。然而为了保证足够大视场，该系统采用的物镜数值孔径为0.04，导致成像分辨率较低，不足以进行高分辨神经成像研究。此外上述几种成像方式的探测光和照明光同轴，这样带来的问题是轴向分辨率普遍较低，且样品受到的光毒性和光漂白作用明显，不利于对样品进行长时间成像。然而对自由活动样本的研究往往需要长时间的观察，因此上述方法都存在一定弊端。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种不会对样本产生影响的、具有高横向和轴向分辨率、高成像速度的用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统，其特征在于，包括按照光路依次设置的光源模块、横向视场扩展模块、扫描模块、照明模块和探测模块，所述光源模块产生的光经过横向视场扩展模块以获得扩展最终照明区域的有效视场，所述扫描模块将从横向视场扩展模块接收的线光束扫描成为面光束；所述照明模块包括分束镜、第一照明物镜、第二照明物镜、光束偏折中继系统、样品和照明单元，所述分束镜将所述扫描模块的面光束分为两路，其中一路直接经第一照明物镜聚焦到样品上进行荧光激发；另一路经过光束偏折中继系统后再经过第二照明物镜聚焦到样品上进行荧光激发，所述照明单元发射近红外光照射到样本上；所述探测模块包括大视场高分辨物镜、第六透镜、变焦透镜、第七透镜、二向色镜、第八透镜、第九透镜、红外相机、微机电系统振镜、第五扫描透镜、第六扫描透镜和互补金属氧化物半导体相机，所述大视场高分辨物镜用于收集携带样本结构信息的近红外光以及激发的荧光，所述大视场高分辨物镜、第六透镜、变焦透镜、第七透镜、二向色镜、微机电系统振镜依次设置，经过二向色镜分光后，长波长的近红外光被反射经过第八透镜和第九透镜进入大靶面红外相机的探测单元成像，透过二向色镜的短波长荧光入射到微机电系统振镜上，后经过第五扫描透镜和第六扫描透镜，最终由互补金属氧化物半导体相机进行荧光探测成像。优选地，所述光源模块包括依次设置的激光器、准直透镜和第一反射镜。优选地，所述横向视场扩展模块包括依次设置的空间光调制器、第一透镜、掩膜版、第二透镜和第三透镜，所述空间光调制器用于接收第一反射镜反射的光束。优选地，所述横向视场扩展模块包括依次设置的第五反射镜、电动液体变焦透镜、第十透镜和第十一透镜，所述第五反射镜用于接收第一反射镜反射的光束。优选地，所述第二透镜和第三透镜组成第一4f中继系统，所述第十透镜和第十一透镜组成第四4f中继系统。优选地，所述扫描模块包括依次设置的第一扫描振镜、第一扫描透镜、第二扫描透镜、第二扫描振镜、第三扫描透镜以及第四扫描透镜，所述第一扫描透镜和第二扫描透镜组成第二4f中继系统，所述第三扫描透镜和第四扫描透镜组成第三4f中继系统。优选地，所述光束偏折中继系统包括依次设置的第二反射镜、第四透镜、第三反射镜、第五透镜和第四反射镜。优选地，第一扫描振镜的镜面、第二扫描振镜的镜面、第一照明物镜的入瞳面和第二照明物镜的入瞳面四者为共轭面。优选地，所述分束镜为50:50分束镜，第一照明物镜和第二照明物镜为相同型号的物镜且二者的入瞳面共轭。优选地，第二扫描振镜的镜面与入射光线的角度为45度，电动变焦透镜的屈光度为0度。本专利技术提出了一种用于在细胞级分辨率下观察自由活动斑马鱼的光片显微成像系统。将大视场高分辨率成像与光片照明相结合的显微镜系统，提升了轴向分辨率减小了光毒性和光漂白对样品的影响，并且对斑马鱼成像过程中不会对其产生任何影响。有益效果主要包括：(1)本专利技术采用一个大视场物镜，对斑马鱼的整个活动区域成像，探测端分别采用两个相机，其中一个大靶面相机对斑马鱼进行定位，一个SCMOS相机对斑马鱼进行成像，并且在后续光路中利用一个振镜使得斑马鱼的荧光信号始终照在SCMOS相机靶面上，本专利技术的这种成像方式，不会对斑马鱼产生任何的干扰，在进行神经成像时，尤其是研究行为与神经之间的关系时，不会因物理位移对其神经信号产生影响，而导致结果不准确，此外振镜控制的视场偏转，响应速度上优于位移台的移动，具有更高的准确度；(2)现有的相关研究中进行成像都是照明光路和探测光路同轴的方法，导致成像时轴向分辨率有限，且样品受到的光毒性和光漂白作用明显，本专利技术采用照明光和探测光轴垂直的方式，即光片显微成像模式，提升了这种大视场高横向分辨率场景下的轴向分辨率，减小了样品所受光毒性和光漂白作用，适合进行长时间的成像研究。附图说明图1是本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统，其特征在于，包括按照光路依次设置的光源模块(1)、横向视场扩展模块(2)、扫描模块(3)、照明模块(4)和探测模块(5)，所述光源模块(1)产生的光经过横向视场扩展模块(2)以获得扩展最终照明区域的有效视场，所述扫描模块(3)将从横向视场扩展模块(2)接收的线光束扫描成为面光束；/n所述照明模块(4)包括分束镜(41)、第一照明物镜(440)、第二照明物镜(441)、光束偏折中继系统、样品(45)和照明单元(46)，所述分束镜(41)将所述扫描模块(3)的面光束分为两路，其中一路直接经第一照明物镜(440)聚焦到样品(45)上进行荧光激发；另一路经过光束偏折中继系统后再经过第二照明物镜(441)聚焦到样品(45)上进行荧光激发，所述照明单元(46)发射近红外光照射到样本(45)上；/n所述探测模块(5)包括大视场高分辨物镜(51)、第六透镜(520)、变焦透镜(53)、第七透镜(521)、二向色镜(57)、第八透镜(524)、第九透镜(525)、红外相机(551)、微机电系统振镜(54)、第五扫描透镜(522)、第六扫描透镜(523)和互补金属氧化物半导体相机(550)，所述大视场高分辨物镜(51)用于收集携带样本结构信息的近红外光以及激发的荧光，所述大视场高分辨物镜(51)、第六透镜(520)、变焦透镜(53)、第七透镜(521)、二向色镜(57)、微机电系统振镜(54)依次设置，经过二向色镜(57)分光后，长波长的近红外光被反射经过第八透镜(524)和第九透镜(525)进入大靶面红外相机(551)的探测单元成像，透过二向色镜(57)的短波长荧光入射到微机电系统振镜(54)上，后经过第五扫描透镜(522)和第六扫描透镜(523)，最终由互补金属氧化物半导体相机(550)进行荧光探测成像。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统，其特征在于，包括按照光路依次设置的光源模块(1)、横向视场扩展模块(2)、扫描模块(3)、照明模块(4)和探测模块(5)，所述光源模块(1)产生的光经过横向视场扩展模块(2)以获得扩展最终照明区域的有效视场，所述扫描模块(3)将从横向视场扩展模块(2)接收的线光束扫描成为面光束；
所述照明模块(4)包括分束镜(41)、第一照明物镜(440)、第二照明物镜(441)、光束偏折中继系统、样品(45)和照明单元(46)，所述分束镜(41)将所述扫描模块(3)的面光束分为两路，其中一路直接经第一照明物镜(440)聚焦到样品(45)上进行荧光激发；另一路经过光束偏折中继系统后再经过第二照明物镜(441)聚焦到样品(45)上进行荧光激发，所述照明单元(46)发射近红外光照射到样本(45)上；
所述探测模块(5)包括大视场高分辨物镜(51)、第六透镜(520)、变焦透镜(53)、第七透镜(521)、二向色镜(57)、第八透镜(524)、第九透镜(525)、红外相机(551)、微机电系统振镜(54)、第五扫描透镜(522)、第六扫描透镜(523)和互补金属氧化物半导体相机(550)，所述大视场高分辨物镜(51)用于收集携带样本结构信息的近红外光以及激发的荧光，所述大视场高分辨物镜(51)、第六透镜(520)、变焦透镜(53)、第七透镜(521)、二向色镜(57)、微机电系统振镜(54)依次设置，经过二向色镜(57)分光后，长波长的近红外光被反射经过第八透镜(524)和第九透镜(525)进入大靶面红外相机(551)的探测单元成像，透过二向色镜(57)的短波长荧光入射到微机电系统振镜(54)上，后经过第五扫描透镜(522)和第六扫描透镜(523)，最终由互补金属氧化物半导体相机(550)进行荧光探测成像。


2.根据权利要求1所述的高分辨光片显微成像系统，其特征在于，所述光源模块(1)包括依次设置的激光器(11)、准直透镜(12)和第一反射镜(13)。


3.根据权利要求2所述的高分辨光片显微成像系统，其特征在于，所述横向视场扩展模块(2)包括依次设置的空间...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐欣，张欣，吴越前，吴爽，王吉祥，史国华，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32