一种棉花原生质体制备方法技术

本发明专利技术提供了一种棉花原生质体制备方法，属于植物细胞生物学技术领域，包括如下步骤：(1)取棉花花朵，用刀片将花瓣切成细丝；(2)将细丝置于6孔细胞培养板中，每孔放一个花瓣的量，每孔加入5‑8ml酶解液，之后酶解；(3)酶解结束后对酶解反应液进行过滤；(4)取滤液加入离心管，第一次离心；(5)用枪头吸去离心管内的上清，向原生质体沉淀中加入第一W5溶液，第二次离心，再次用枪头吸去上清，然后再加入第二W5溶液重悬原生质体沉淀，得到的原生质体重悬液。可在1.5‑2小时内完成棉花原生质体的制备，大大缩短了棉花原生质体制备所需要的时间，并有利于保证原生质体活力，数量也能满足后续瞬时转化的需要，大大提高了棉花原生质体制备效率。

A method of cotton protoplast preparation

【技术实现步骤摘要】
一种棉花原生质体制备方法
本专利技术涉及植物细胞生物学
，具体涉及一种棉花原生质体制备方法。
技术介绍
原生质体是植物细胞生物学研究的重要工具，以原生质体为受体进行瞬时转化，可广泛用于目标基因蛋白的亚细胞定位、启动子及蛋白活性检测、BIFC(bimolecularfluorescencecomplementation双分子荧光互补)蛋白与蛋白互作等基因功能研究。原生质体制备在拟南芥、烟草等植物中研究较多，而在棉花中原生质体制备及应用的研究较少。棉花基因的亚细胞定位、BIFC等基因功能分析往往是利用农杆菌介导法或基因枪法瞬时转化洋葱表皮或烟草来实现的。然而，由于不同物种的遗传差异，细胞内环境及所包含的生物分子不同，棉花基因的功能分析在其他物种中异源表达来进行研究存在出现假阳性结果的风险。棉花内源基因的分析及研究在棉花内源表达系统中进行才更具可靠。因此，高效制备棉花原生质体是促进实现在棉花内源表达系统中进行亚细胞定位及BIFC等其他基因功能分析的重要手段。已有棉花原生质体制备以幼嫩叶片为材料，制备过程耗时长，及影响制备效率又一定程度影响原生质体的活力，进而一定程度制约了利用棉花原生质体来进行亚细胞定位、BIFC等研究。
技术实现思路
针对上述现有的棉花原生质体制备以幼嫩叶片为材料，制备过程耗时长，制备效率低下，进一步影响原生质体活力的缺陷，本专利技术提出了一种棉花原生质体制备方法。一种棉花原生质体制备方法，包括如下步骤：(1)取棉花花朵，剥下花瓣并置于培养皿中，用刀片将花瓣切成细丝；(2)将细丝置于6孔细胞培养板中，每孔放一个花瓣的量，每孔加入5-8ml酶解液，之后将细胞培养板置于摇床上震荡酶解；(3)酶解结束后对酶解反应液进行过滤；(4)取滤液加入离心管，第一次离心，原生质体沉淀于离心管底；(5)用枪头吸去离心管内的上清，向原生质体沉淀中加入第一W5溶液，轻轻晃动重悬原生质体沉淀，第二次离心，再次用枪头吸去上清，然后再加入第二W5溶液重悬原生质体沉淀，得到的原生质体重悬液经计数及活力检测后可用于瞬时转化。本申请的技术方案中，以棉花花瓣为材料制备棉花原生质体，进行酶解、过滤、两次离心沉淀后得到原生质体重悬液，可在1.5-2小时内完成棉花原生质体的制备，大大缩短了棉花原生质体制备所需要的时间，并有利于保证原生质体活力，数量也能满足后续瞬时转化的需要，大大提高了棉花原生质体制备效率，解决了上述现有的棉花原生质体制备以幼嫩叶片为材料，制备过程耗时长，制备效率低下，进一步影响原生质体活力的缺陷。优选的，步骤(1)中棉花花朵为开花当天的新鲜棉花花朵，细丝的宽度为0.8-1.2mm更为优选的，细丝的宽度为1mm。优选的，步骤(2)中酶解液加入后，将细胞板置于28℃摇床，15转/分钟震荡，酶解1-1.5个小时。更为优选的，酶解1.25小时。优选的，步骤(3)中酶解结束后，用六层400目的尼龙网对酶解反应液进行过滤。优选的，步骤(4)中，滤液加入50ml离心管中，第一次离心为800rpm-1000rpm室温离心3-5min。更为优选的，步骤(4)中，滤液加入50ml离心管中，第一次离心为900rpm室温离心4min。优选的，步骤(5)中，第二次离心为800rpm-1000rpm离心5min，第一W5溶液10ml和第二W5溶液2ml。更为优选的，第一W5溶液和第二W5溶液相同，均包括0.9009g的NaCl、1.3875g的CaCl2、0.0373g的KCl、0.03905g的MES、0.09g的葡萄糖，并用无菌水定容至100ml。此时制备的第一W5溶液或第二W5溶液为100ml。优选的，步骤(2)中酶解液包括0.9g-1.2g纤维素酶、0.3g-0.5g的离析酶、6.558g-9.473g的甘露醇、0.1491g的KCl、0.3905g的MES、0.111gCaCl2、0.5g的PVP，并用无菌水定容至100ml。制备的酶解液为100ml。更为优选的，步骤(2)中酶解液包括1.05g纤维素酶、0.4g的离析酶、8.016g的甘露醇、0.1491g的KCl、0.3905g的MES、0.111gCaCl2、0.5g的PVP，并用无菌水定容至100ml。制备的酶解液为100ml。相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：(1)酶解时间短，仅需要1-1.5个小时；(2)可在1.5-2小时内完成棉花原生质体的制备，大大缩短了棉花原生质体制备所需要的时间，并有利于保证原生质体活力；(3)数量也能满足后续瞬时转化的需要，大大提高了棉花原生质体制备效率；(4)制备的棉花原生质体可用于棉花基因的瞬时转化，来进行亚细胞定位、BIFC等棉花基因功能分析。附图说明图1为本专利技术10倍镜下1小时制备得到的棉花原生质体。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对本专利技术作优选的详细说明。实施例1一种棉花原生质体制备方法，包括如下步骤：(1)取棉花花朵，剥下花瓣并置于培养皿中，用刀片将花瓣切成细丝，棉花花朵为开花当天的新鲜棉花花朵，细丝的宽度为0.8mm；(2)将细丝置于6孔细胞培养板中，每孔放一个花瓣的量，每孔加入5ml酶解液，之后将细胞培养板置于摇床上震荡酶解，酶解液加入后，将细胞板置于28℃摇床，15转/分钟震荡，酶解1个小时，酶解液包括0.9gg纤维素酶、0.3gg的离析酶、6.558gg的甘露醇、0.1491g的KCl、0.3905g的MES、0.111gCaCl2、0.5g的PVP，并用无菌水定容至100ml；(3)酶解结束后对酶解反应液进行过滤，酶解结束后，用六层400目的尼龙网对酶解反应液进行过滤；(4)取滤液加入离心管，第一次离心，原生质体沉淀于离心管底，滤液加入50ml离心管中，第一次离心为800rpm室温离心5min；(5)用枪头吸去离心管内的上清，向原生质体沉淀中加入第一W5溶液，轻轻晃动重悬原生质体沉淀，第二次离心，再次用枪头吸去上清，然后再加入第二W5溶液重悬原生质体沉淀，得到的原生质体重悬液经计数及活力检测后可用于瞬时转化，第二次离心为800rpm离心5min，第一W5溶液10ml和第二W5溶液2ml；第一W5溶液和第二W5溶液相同，包括0.9009g的NaCl、1.3875g的CaCl2、0.0373g的KCl、0.03905g的MES、0.09g的葡萄糖，并用无菌水定容至100ml。实施例2一种棉花原生质体制备方法，包括如下步骤：(1)取棉花花朵，剥下花瓣并置于培养皿中，用刀片将花瓣切成细丝，棉花花朵为开花当天的新鲜棉花花朵，细丝的宽度为1mm；(2)将细丝置于6孔细胞培养板中，每孔放一个花瓣的量，每孔加入6.5ml酶解液，之后将细胞培养板置于摇床上震荡酶解，酶解液加入后，将细胞板置于2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种棉花原生质体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)取棉花花朵，剥下花瓣并置于培养皿中，用刀片将花瓣切成细丝；/n(2)将细丝置于6孔细胞培养板中，每孔放一个花瓣的量，每孔加入5-8ml酶解液，之后将细胞培养板置于摇床上震荡酶解；/n(3)酶解结束后对酶解反应液进行过滤；/n(4)取滤液加入离心管，第一次离心，原生质体沉淀于离心管底；/n(5)用枪头吸去离心管内的上清，向原生质体沉淀中加入第一W5溶液，轻轻晃动重悬原生质体沉淀，第二次离心，再次用枪头吸去上清，然后再加入第二W5溶液重悬原生质体沉淀，得到的原生质体重悬液经计数及活力检测后可用于瞬时转化。/n

【技术特征摘要】
1.一种棉花原生质体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取棉花花朵，剥下花瓣并置于培养皿中，用刀片将花瓣切成细丝；
(2)将细丝置于6孔细胞培养板中，每孔放一个花瓣的量，每孔加入5-8ml酶解液，之后将细胞培养板置于摇床上震荡酶解；
(3)酶解结束后对酶解反应液进行过滤；
(4)取滤液加入离心管，第一次离心，原生质体沉淀于离心管底；
(5)用枪头吸去离心管内的上清，向原生质体沉淀中加入第一W5溶液，轻轻晃动重悬原生质体沉淀，第二次离心，再次用枪头吸去上清，然后再加入第二W5溶液重悬原生质体沉淀，得到的原生质体重悬液经计数及活力检测后可用于瞬时转化。


2.根据权利要求1所述的一种棉花原生质体制备方法，其特征在于，步骤(1)中棉花花朵为开花当天的新鲜棉花花朵，细丝的宽度为0.8-1.2mm。


3.根据权利要求2所述的一种棉花原生质体制备方法，其特征在于，细丝的宽度为1mm。


4.根据权利要求1所述的一种棉花原生质体制备方法，其特征在于，步骤(2)中酶解液加入后，将细胞板置于28℃摇床，15转/分钟震荡，酶解1-1.5个小时。


5.根据权利要求4所述的一种棉花原生质体制备方法，其特征在于，酶解1.25...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雪，刘传亮，孙瑞斌，王少辉，马丹，栗祎琳，刘志红，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41