一种苦瓜外泌体及其提取方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种苦瓜外泌体及其提取方法与应用，提取步骤如下：取适量新鲜云南山野苦瓜，去籽洗净并晾干；榨取苦瓜汁，将苦瓜汁连续离心，离心后取上清，弃沉淀；将取得的上清超速离心，弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1‑2mL的磷酸缓冲盐溶液中；将悬浮液用0.22μm的滤膜过滤，滤液再次于超速冷冻离心机中离心，弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1‑2mL的磷酸缓冲盐溶液中。提取的苦瓜外泌体可用于制备治疗缺血性脑中风药物。本发明专利技术的提取方法方便有效，提取纯度高，提取的苦瓜外泌体具有脑卒中后神经损伤的保护作用。

Exosomes of Momordica charantia and its extraction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种苦瓜外泌体及其提取方法与应用
本专利技术涉及医药领域，具体涉及一种苦瓜外泌体及其提取方法与应用。
技术介绍
缺血性脑中风具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点。脑中风包括出血性脑中风和缺血性脑中风，其中缺血性脑中风约占87％，缺血性脑中风主要由于大脑血管堵塞造成血流减少，大脑供血不足引起。临床上治疗脑中风的方法是用t-PA溶栓，但是t-PA具有严格的治疗时间窗为4.5h，超过治疗时间窗会引起出血转换(更严重的损伤)，临床上迫切需要更为安全、有效的治疗药物。外泌体(Exosomes)是细胞释放到环境中粒径大小为30-200nm的细胞外囊泡，呈蝶状，由特定的蛋白质、脂质和核酸物质组成。其携带的多种miRNA能与靶细胞膜表面的特定受体结合，调控多种信号通路，调节多种生理和病理过程。能否从苦瓜中提取外泌体，并用于缺血性脑卒中的治疗中，未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种苦瓜外泌体的提取方法，能够从植物苦瓜中提取外泌体。本专利技术的目的之二是提供上述方法提取的苦瓜外泌体在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种苦瓜外泌体的提取方法，包括以下步骤：(1)取适量新鲜云南山野苦瓜，去籽洗净并晾干；(2)晾干后榨取苦瓜汁，将苦瓜汁连续离心，于4℃，1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min；离心后取上清，弃沉淀；(3)将取得的上清超速离心，于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1-2mL的PBS缓冲液中；(4)将悬浮液用0.22μm的滤膜过滤，滤液再次于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1-2mL的PBS缓冲液中。本专利技术还提供上述方法提取的苦瓜外泌体。利用透射电镜观察，苦瓜外泌体是具有清晰膜的茶托样膜泡结构，粒径主要集中在120nm左右，免疫印迹检测存在三种标志蛋白CD54、CD63、TSG101。本专利技术还提供上述方法提取的苦瓜外泌体在制备治疗脑中风药物中的应用。利用大鼠大脑中动脉梗塞MCAO(middlecerebralarteryoc-clusion，MCAO)脑中风模型，验证苦瓜外泌体的脑保护作用。栓塞缺血2小时，再通血管前30分钟静脉注射苦瓜外泌体(800ug/kg)，在复灌24小时进行：TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色观察梗死面积，mNSS神经评分，EB染色并EB定量，观察BBB(血脑屏障)的通透性。结果发现，苦瓜外泌体能够减少MCAO大鼠的脑梗死面积，能减轻MCAO大鼠的神经评分，减少EB的渗透、减轻血脑屏障的损伤。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1.本专利技术提供的苦瓜外泌体提取方法，方便有效，杂质去除率高，提取纯度高。2.本专利技术提取的苦瓜外泌体能够减少MCAO大鼠的脑梗死面积，并能减轻MCAO大鼠的神经评分，能够减少MCAO大鼠EB的渗透，对MCAO大鼠血脑屏障具有保护作用，说明苦瓜外泌体具有脑卒中后神经损伤的保护作用。附图说明图1为本专利技术实施例1的苦瓜外泌体提取流程图；图2为本专利技术实施例1提取的苦瓜外泌体的透射电镜图；图3为本专利技术实施例1提取的苦瓜外泌体的粒径分布图；图4为本专利技术实施例1提取的苦瓜外泌体的标志蛋白条带图；图5为检测脑梗死的TTC染色图；图6为TTC染色定量分析图；图7为mNSS神经评分图；图8为EB渗透检测血脑屏障的大脑切片图；图9为EB定量分析图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例1：苦瓜外泌体的提取方法参见附图1所示的提取流程，取新鲜云南山野苦瓜500g，去籽洗三次，每次1-3min，洗完晾干；晾干后用鲜榨原汁机榨取苦瓜汁，约200ml，将苦瓜汁连续离心，于4℃，1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min；离心后取上清，弃沉淀；将取得的上清超速离心，于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1-2ml的PBS缓冲液中；将悬浮液用0.22um的滤膜过滤，滤液再次于超速离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后取沉淀，弃上清，沉淀悬浮于1-2ml的PBS缓冲液中。将提取的苦瓜外泌体置于透射电镜下观察形态，步骤如下：将新鲜低温超速离心所得的苦瓜外泌体溶液滴在封口膜洁净面；将铜网膜面放在苦瓜外泌体液滴上，悬浮10分钟，用滤纸缓慢吸干；转移铜网至3％戊二醛液滴上，悬浮5分钟，用滤纸吸干；转移铜网至DW液滴上，10次，每次2分钟，每次均用滤纸吸干；转移铜网至4％醋酸双氧铀液滴上，10分钟，用滤纸吸干；自然晾干后(30分钟)，TEM观察记录。结果如图2所示，在电镜视野中大多是小于200nm的具有清晰膜的茶托样膜泡结构。测量提取的苦瓜外泌体的粒径，将外泌体与磷酸盐缓冲液1:10稀释混匀，加500微升至专用的比色皿中进行检测，结果如图3所示，外泌体大小主要集中在120nm左右，属于外泌体的大小(30-200nm)范围。采用免疫印迹法测定外泌体的三种标志蛋白CD54、CD63、TSG101，外泌体标志蛋白条带清晰可见(如图4所示)。实施例2：苦瓜外泌体的脑保护作用1、实验动物雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重250±20g，清洁级，由徐州医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK(沪)2018-0006。2、主要试剂苦瓜外泌体：按实施例所述方法提取；TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑；上海生工)、伊文思蓝(EB；北京伊诺凯科技有限公司)、三氯乙酸(北京伊诺凯科技有限公司)、CD54/ICAM-1Antibody#4915(CST)、TSG101Antibody(proteintech)、CD63Antibody(proteintech)3、仪器超速冷冻离心机(BeckmanOptimaL-100XP)、透射电子显微镜(TecnaiG2SpiritTwin*TecnaiG2SpiritTwin)、Zeta电位检测仪(Nicomp380ZLS)、小动物麻醉机(ABS-100)、Tanon电泳仪(EPS300)4、MCAO模型的建立、分组和给药SD大鼠随机分成：空白对照组、MCAO组、MCAO+苦瓜外泌体组，每组5只。MCAO模型制作：SD大鼠以异氟烷吸入麻醉后，于颈正中偏右竖向切开，分离周围组织，暴露大鼠左侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，用缝合线系紧CCA近心端及ECA，用微动脉夹夹闭ICA，在CCA结扎处与上端三叉口之间持眼科剪斜45°剪一小口，将对应体重的标准线栓小心地从剪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苦瓜外泌体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)取适量新鲜云南山野苦瓜，去籽洗净并晾干；/n(2)晾干后榨取苦瓜汁，将苦瓜汁连续离心，于4℃，1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min；离心后取上清，弃沉淀；/n(3)将取得的上清超速离心，于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1-2mL的磷酸缓冲盐溶液中；/n(4)将悬浮液用0.22μm的滤膜过滤，滤液再次于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1-2mL的磷酸缓冲盐溶液中。/n

【技术特征摘要】
1.一种苦瓜外泌体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取适量新鲜云南山野苦瓜，去籽洗净并晾干；
(2)晾干后榨取苦瓜汁，将苦瓜汁连续离心，于4℃，1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min；离心后取上清，弃沉淀；
(3)将取得的上清超速离心，于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐素华，顾兵，蔡恒，黄琳燕，王彦玲，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32