苦瓜外泌体的提取方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用技术

本发明专利技术公开了一种苦瓜外泌体的提取方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，提取步骤如下：取适量新鲜云南山野苦瓜，去籽洗净并晾干；榨取苦瓜汁，将苦瓜汁连续离心，离心后取上清，弃沉淀；将取得的上清超速离心，弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1‑2mL的磷酸缓冲盐溶液中；将悬浮液用0.22μm的滤膜过滤，滤液再次于超速冷冻离心机中离心，弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1‑2mL的磷酸缓冲盐溶液中。提取的苦瓜外泌体可用于制备抗肿瘤药物。本发明专利技术的提取方法方便有效，提取纯度高，提取的苦瓜外泌体能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移浸润，同时能够促进肿瘤细胞的凋亡，达到有效治疗肿瘤疾病的效果。

Extraction of exosomes from Momordica charantia and its application in the preparation of antitumor drugs

【技术实现步骤摘要】
苦瓜外泌体的提取方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用
本专利技术涉及医药领域，具体涉及一种苦瓜外泌体的提取方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
临床应用的抗肿瘤药物有化疗药物、生物制剂等，但是这些药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞有很强的杀伤作用。近年来，随着分子肿瘤学、分子药理学的发展，抗肿瘤药正从传统的非选择性单一的细胞毒性药物转向多环节作用的新型药物，抗肿瘤药物的研究与开发已进入一个崭新的时代。外泌体是由特定的蛋白质、脂质和核酸物质组成，携带多种miRNA，能够与靶细胞膜表面的特定受体结合，调控多种信号通路，调节各种生理和病理过程。能否从苦瓜中提取外泌体，并用于抗肿瘤治疗中，未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种苦瓜外泌体的提取方法，能够从植物苦瓜中提取外泌体。本专利技术的目的之二是提供上述方法提取的苦瓜外泌体在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种苦瓜外泌体的提取方法，包括以下步骤：(1)取适量新鲜云南山野苦瓜，去籽洗净后晾干；(2)晾干后榨取苦瓜汁，将苦瓜汁连续离心，于4℃，1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min；离心后取上清，弃沉淀；(3)将取得的上清超速离心，于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1-2mL的PBS缓冲液中；(4)将悬浮液用0.22μm的滤膜过滤，滤液再次于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1-2mL的PBS缓冲液中。本专利技术还提供上述方法提取的苦瓜外泌体在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提供上述方法提取的苦瓜外泌体在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。其中，所述肿瘤细胞为T98G胶质瘤细胞或HepG2肝癌细胞。将苦瓜外泌体与人胶质瘤细胞(T98G)、正常神经细胞(HT22)、人肝癌细胞(HepG2)、正常肝细胞(QSG7701)共培养，通过细胞计数试剂盒(CCK-8)实验发现，在0.3-3μg/mL浓度范围内，苦瓜外泌体能明显抑制肿瘤细胞T98G、HepG2的增殖，而对正常细胞HT22、QSG7701没有抑制作用。在苦瓜外泌体浓度为3μg/mL的条件下，通过细胞克隆形成实验、细胞迁移实验(Transwell小室)证实苦瓜外泌体可以抑制T98G系的胶质瘤细胞和HepG2人肝癌细胞的增殖和迁移浸润；通过蛋白质免疫印迹实验Bcl-2/Bax的比值降低，证明外泌体能够促进肿瘤细胞的凋亡。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1.本专利技术提供的苦瓜外泌体提取方法能够从植物苦瓜中提取得到外泌体，方便有效，提取纯度高；2.本专利技术提取的苦瓜外泌体能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移浸润，同时能够促进肿瘤细胞的凋亡，达到有效治疗肿瘤疾病的效果，从而实现在制备抗肿瘤的药物中的用途。附图说明图1为本专利技术实施例1的苦瓜外泌体提取流程图；图2为本专利技术实施例1提取的苦瓜外泌体的透射电镜图；图3为本专利技术实施例1提取的苦瓜外泌体的粒径分布图；图4为本专利技术实施例1提取的苦瓜外泌体的标志蛋白条带图；图5为本专利技术实施例2的肿瘤细胞T98G、HepG2和正常细胞HT22、QSG7701的活性检测CCK8实验；图6为本专利技术实施例2的T98G胶质瘤细胞克隆形成实验：A图中ctrl代表空白对照组，Exosome代表苦瓜外泌体组，B图是形成细胞克隆的数量统计图；图7为本专利技术实施例2的HepG2肝癌细胞克隆形成实验：A图中ctrl代表空白对照组，Exosome代表苦瓜外泌体组，B图是形成细胞克隆的数量统计图；图8为本专利技术实施例2的T98G胶质瘤细胞的细胞迁移浸润实验(Transwell小室)：A图中ctrl代表空白对照组，Exosome代表苦瓜外泌体组，B图是迁移浸润细胞数量统计图；图9为本专利技术实施例2的HepG2肝癌细胞的细胞迁移浸润实验(Transwell小室)：A图中ctrl代表空白对照组，Exosome代表苦瓜外泌体组，B图是迁移浸润细胞数量统计图；图10为本专利技术实施例2的T98G胶质瘤细胞蛋白质印迹法检测：A图是蛋白质印迹检测结果图，B图是Bcl-2/Bax比值的统计图；图11为本专利技术实施例2的HepG2肝癌细胞蛋白质印迹法检测：C图是蛋白质印迹检测结果图，D图是Bcl-2/Bax比值的统计图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例1：苦瓜外泌体的提取方法参见附图1所示的提取流程，取新鲜云南山野苦瓜500g，去籽洗三次，每次1-3min，洗完晾干；晾干后用鲜榨原汁机榨取苦瓜汁，约200mL，将苦瓜汁连续离心，于4℃，1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min；离心后取上清，弃沉淀；将取得的上清超速离心，于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1-2mL的PBS缓冲液中；将悬浮液用0.22um的滤膜过滤，滤液再次于超速离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后取沉淀，弃上清，沉淀悬浮于1-2mL的PBS缓冲液中。将提取的苦瓜外泌体置于透射电镜下观察形态，步骤如下：将新鲜低温超速离心所得的苦瓜外泌体溶液滴在封口膜洁净面；将铜网膜面放在苦瓜外泌体液滴上，悬浮10分钟，用滤纸缓慢吸干；转移铜网至3％戊二醛液滴上，悬浮5分钟，用滤纸吸干；转移铜网至DW液滴上，10次，每次2分钟，每次均用滤纸吸干；转移铜网至4％醋酸双氧铀液滴上，10分钟，用滤纸吸干；自然晾干后(30分钟)，TEM观察记录。结果如图2所示，本实施例提取的外泌体在电镜视野中大多是120nm左右的具有清晰膜的茶托样膜泡结构。测量提取的苦瓜外泌体的粒径，将外泌体与磷酸盐缓冲液1:10稀释混匀，加500微升至专用的比色皿中进行检测，结果如图3所示，外泌体大小主要集中在120nm左右，属于外泌体的大小(30-200nm)范围。用免疫印迹法测定外泌体的三种标志蛋白CD54、CD63、TSG101，外泌体标志蛋白条带清晰可见(如图4所示)。实施例2：苦瓜外泌体在制备抗肿瘤药物中的应用(1)实验材料和药品1实验药品：DMEM培养基，小牛血清，0.25％胰蛋白酶，磷酸盐缓冲液，苦瓜外泌体，结晶紫，4％多聚甲醛，蛋白印迹试剂盒，电子显微镜观察外泌体试剂盒，CCK-8试剂盒。2实验仪器和材料：二氧化碳培养箱，倒置显微镜，超净台，电子显微镜，培养皿，巴氏吸管，离心管，牛鲍计数板，加样枪，一次性枪头，6孔板，酒精灯，培养细胞(HT22海马神经元细胞、T98G人胶质瘤细胞、7701人肝细胞、HepG2人肝癌细胞，均购自于中国科学院上海细胞库)。(2)实验步骤1、细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苦瓜外泌体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)取适量新鲜云南山野苦瓜，去籽洗净并晾干；/n(2)晾干后榨取苦瓜汁，将苦瓜汁连续离心，于4℃，1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min；离心后取上清，弃沉淀；/n(3)将取得的上清超速离心，于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1-2mL的磷酸缓冲盐溶液中；/n(4)将悬浮液用0.22μm的滤膜过滤，滤液再次于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1-2mL的磷酸缓冲盐溶液中。/n

【技术特征摘要】
1.一种苦瓜外泌体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取适量新鲜云南山野苦瓜，去籽洗净并晾干；
(2)晾干后榨取苦瓜汁，将苦瓜汁连续离心，于4℃，1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min；离心后取上清，弃沉淀；
(3)将取得的上清超速离心，于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心90min，离心后弃上清，取沉淀，沉淀悬浮于1-2mL的磷酸缓冲盐溶液中；
(4)将悬浮液用0.22...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐素华，马萍，王斌，顾兵，王婉，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32