一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法及试剂包技术

本发明专利技术属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种用于基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法。本发明专利技术还涉及一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法所用试剂。本发明专利技术所提供的方法对ABO基因全长序列包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子序列进行长片段PCR扩增、扩增产物文库制备、Illumina平台测序上机以及生物信息学分析。本发明专利技术所提供的试剂和方法可作为一种全新的、独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了ABO精确分型的问题，发挥NGS技术对ABO基因分型高通量、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。

A method and kit for determining the full length sequence of ABO gene based on ngs Technology

【技术实现步骤摘要】
一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法及试剂包
本专利技术属于基因分型检测方法
，具体涉及一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法。本专利技术还涉及一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定用试剂包。
技术介绍
ABO血型系统是目前已知的39个红细胞血型系统中最具临床意义的血型系统，对ABO血型抗原系统进行准确分型和诊断可以明确个体血型基因型。ABO血型系统基因定位于9号染色体，基因组全长19514b，(未计算5’UTR和3’UTR区域)，由7个外显子和6个内含子组成。目前ABO血型系统基因分型技术有PCR-SSP、PCR-SSO、PCR-SBT、实时荧光PCR技术、基因芯片等。上述方法中除PCR-SBT方法外，其他几种方法是基于已知的多态性位点进行设计，测定的碱基序列范围有限；尽管PCR-SBT方法克服了上述缺陷，但是该方法也仅仅是对编码区序列进行检测，加之操作过程繁琐，难以实现高通量检测。研究发现ABO亚型标本的突变点或其形成机制涉及的序列范围广，需覆盖ABO全长序列的范围才能鉴别出亚型，明确可能形成的机制，然而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，其特征在于：所述方法对ABO基因全长序列包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子序列进行长片段PCR扩增、扩增产物文库制备、Illumina平台测序上机以及生物信息学分析，并包括以下步骤：/n（1）针对ABO基因序列的特异性，设计并合成长片段PCR扩增引物；/n（2）制备人基因组DNA；/n（3）分两组PCR反应扩增人基因组DNA中ABO基因包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子区域序列；/n（4）将步骤（3）得到的扩增产物进行磁珠法纯化；/n（5）通过Qubit DNA双链定量测定试剂将步骤（4...

【技术特征摘要】
1.一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，其特征在于：所述方法对ABO基因全长序列包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子序列进行长片段PCR扩增、扩增产物文库制备、Illumina平台测序上机以及生物信息学分析，并包括以下步骤：
（1）针对ABO基因序列的特异性，设计并合成长片段PCR扩增引物；
（2）制备人基因组DNA；
（3）分两组PCR反应扩增人基因组DNA中ABO基因包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子区域序列；
（4）将步骤（3）得到的扩增产物进行磁珠法纯化；
（5）通过QubitDNA双链定量测定试剂将步骤（4）得到的两组纯化产物进行准确定量分析，并将两组纯化产物进行等摩尔混合；
（6）将步骤（5）得到的等摩尔混合产物进行文库制备，包括扩增产物采用转座子酶法片段化、片段化产物磁珠法纯化、Index序列扩增和文库扩增后片段选择；
（7）将步骤（6）获得的文库通过Aligent4200电泳仪进行质量检测，分析文库的片段大小，并通过QubitDNA双链定量测定试剂准确定量后进行文库混合；
（8）采用Illumina测序试剂，将步骤（7）获得的混合文库进行IlluminaMiseq平台测序上机；
（9）将步骤（8）得到的FASTQ原始数据，采用CLCMainWorkbench12.0software专用软件进行生物信息学分析，指定个体ABO基因型。


2.根据权利要求1所述的基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，其特征在于：所述步骤（3）中两组PCR反应体系包括：
第1组扩增ABO基因5’UTR部分区域、第1号外显子至第1号内含子的反应体系：5×GLXPCR缓冲液5.0μl；2.5mMdNTP2.0μl；引物浓度25µM，ABO1longF和ABO1longR各0.2µl；1.25U/µlGLX-Taq酶0.5µl；50-100ng/µlDNA4.0µl；以H2O13.1µl补足至25µl，其中：ABO1longF的序列为GCTTCCAGCTTTTGGCTATG，ABO1longR的序列为GTGACCACGGAGCGATTTAT；
第2组扩增ABO基因第1号内含子至第7号外显子的反应体系：5×GLXPCR缓冲液5.0μl；2.5mMdNTP2.0μl；引物浓度25µM，ABOe27longF和ABOe27longR各0.2µl；1.25U/µlGLX-Taq酶0.5µl；50-100ng/µlDNA4.0µl；以H2O13.1µl补足至25µl；其中：ABOe27longF的序列为GGATTAACAATGGCGTGCTT，ABOe27longR的序列为GGACGGACAAAGGAAACAGA。


3.根据权利要求1所述的基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，其特征在于：所述步骤（3）中两组PCR反应程序均为：
94℃预变性1min，98℃变性10s，68℃退火加延伸10min，30个...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱发明，和艳敏，洪小珍，应燕玲，许先国，何吉，
申请(专利权)人：浙江省血液中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33