一种高效简便获取木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物和方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种高效简便获取木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物和方法及其应用。所述通用引物包括6对引物：Psyllid‑1、Psyllid‑2、Psyllid‑3、Psyllid‑4、Psyllid‑5和Psyllid‑6，其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～12所示。本发明专利技术首次提供了一种用于扩增木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物，可用于获取木虱总科昆虫整个线粒体基因组信息；本发明专利技术的通用引物需要的引物对数少，通过常规PCR和一代测序即可获得完整的属于木虱总科的昆虫线粒体基因组信息，扩增效率高、快捷、操作简便、价格便宜，对操作仪器和分析设备要求较低，容易实现，且扩增和分析过程中不受昆虫本身和其他内生菌基因组干扰，具有较大的应用前景。

A universal primer and method for obtaining mitochondrial genome of Psylloidea and its application

【技术实现步骤摘要】
一种高效简便获取木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物和方法及其应用
本专利技术涉及分子标记
，更具体地，涉及一种高效简便获取木虱总科线粒体基因组的通用引物和方法及其应用。
技术介绍
线粒体是绝大多数真核生物细胞氧化供能的主要细胞器，它的存在关系着细胞的生存和凋亡，该细胞器中有一套独立于核染色体的基因组——线粒体基因组(Ridley,2006)。近年来，线粒体全基因组在研究昆虫进化和种群数量中起到重要作用，主要是因为该基因组相对较小、基因数目少、重组率低、碱基突变率高、可遗传性和相对浓度高等特点，因此它是研究昆虫分子分类、系统进化、群体遗传和变异等方面很好的分子遗传标记(Boore,1999；Clayton,1992；Taanman,1999；Wolstenholme,1992)。昆虫线粒体基因组除了少数例外，一个完整的环形昆虫线粒体主要包括：13个编码基因(Protein-codinggenes,PCGs)，2个核糖体RNA基因(rRNA)，22个转移RNA基因(tRNA)和一个富含AT的非编码区(控制区)。线粒体基因组排序相对比较稳定，保留祖先的基因排列顺序(Cameron,2014)。目前全世界通过形态学描述的木虱总科已经超过3000种(Forero,2008；Hollis,2004)，其中部分属于农业生产上的重要害虫和传病媒介。分子系统方法的出现允许更加精确和快速地描述入侵物种群体之间的多样性，可比形态学评估确定更多信息。目前GenBank数据库公布的完整线粒体基因组中属于木虱总科有：隶属于木虱科的木通木虱Cacopsyllacoccinea和朴树木虱Pachypsyllavenusta(Queetal.,2015；Thaoetal.,2004)，隶属于个木虱科的枸杞木虱Paratriozasinica和马铃薯木虱Bactericeracockerelli(Zhangetal.,2016；Wuetal.,2016a)，隶属于扁木虱科的柑橘木虱Diaphorinacitri(Wuetal.,2016b)，随着二代测序技术的引进促进基因组(包括昆虫线粒体基因组)的快速发展(Cantacessietal.,2010；Williamsetal.,2014)。但高通量测序价格相对较高，对数据分析能力和软硬件要求也较高，难以得到充分推广。目前细胞色素氧化酶1(cox1)基因的部分片段已被广泛用于部分木虱昆虫物种多态性分析、个体或种群的系统发育和鉴定当中，特别是对于遗传距离较远的样品(Boykinetal.,2012；DeLeónetal.,2011；Lashkarietal.,2014)。Wu等(2016)报道了cox1基因在木虱总科的线粒体基因组中是最保守的。然而只分析单一基因生物信息量较少，对于遗传距离较近的木虱种群可能与事实发生偏离，多个基因或线粒体全基因组序列综合分析结果才更加准确(Yamauchietal.,2003)，能够初步得知比cox1基因变化率更大的基因组区域，找到更多的碱基突变位点SNPs，从而鉴定出更多的单倍型，获得更加准确的鉴别结果。除了cox1基因，其他线粒体基因同样具有分析种群差异的潜力。因此，获得木虱线粒体全基因组序列可提供更多生物信息，是分析遗传距离较近的样品种群的前提。先前报道的木虱线粒体的通用引物主要用于扩增cox1基因的部分区域，无法获取其线粒体全基因组信息；而Simon等(2006)设计的动物线粒体基因组测序的通用引物，该套引物是基于10个昆虫目18种昆虫、2种节肢动物、2种脊椎动物和3种无脊椎动物线粒体基因组序列比对而设计的。这套引物虽然已被广泛使用，但由于动物线粒体基因组结构变异大，碱基突变位点高，该套引物的通用性并不高，在使用中存在诸多不足，不是所有引物对都能在整个线粒体基因组扩增中起到很好的效果，申请人前期发现，该套通用引物并不适用于木虱总科的昆虫样品，扩增效果较差，特别是无法在变异性较高的基因上起作用，没办法用于实际研究。因此，亟需开发一种高效简便、专门用于获取木虱总科昆虫样品线粒体基因组的通用引物，为后续昆虫分子分类、系统进化、群体遗传和变异等方面研究提供更全面的分子遗传标记信息。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种高效简便获取木虱总科线粒体基因组的通用引物。本专利技术的另一目的在于提供一种获取木虱总科线粒体基因组的方法。本专利技术的再一目的在于提供上述通用引物和方法的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一套用于获取木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物，包括6对引物Psyllid-1、Psyllid-2、Psyllid-3、Psyllid-4、Psyllid-5和Psyllid-6，其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～12所示。本专利技术根据现有木虱总科中不同木虱科已知线粒体基因组序列为参考序列，根据已知线粒体基因组的保守区域设计通用引物，扩增条带之间须有交叉，方便后续实验对其进行整体拼接，且引物设计尽量满足基本原则，通过一系列的引物筛选试验，最终得到了上述6对可用于扩增木虱总科线粒体基因组的通用引物。引物对Psyllid-1的上下游引物序列如SEQIDNO.1～2所示，其扩增的片段大小为3498bp；引物对Psyllid-2上下游引物序列如SEQIDNO.3～4所示，其扩增的片段大小为2358bp；引物对Psyllid-3的上下游序列如SEQIDNO.5～6所示，其扩增的片段大小为4855bp；引物对Psyllid-4的上下游序列如SEQIDNO.7～8所示，其扩增的片段大小为1596bp；引物对Psyllid-5的上下游序列如SEQIDNO.9～10所示，其扩增的片段大小为1530bp；引物对Psyllid-6的上下游序列如SEQIDNO.11～12所示，其扩增的片段大小为1319-3287bp。上述通用引物在获取木虱总科线粒体基因组或在制备用于扩增木虱总科线粒体基因组的试剂盒中的应用也在本专利技术保护范围内。一种获取木虱总科线粒体基因组的方法，包括如下步骤：S1.提取待测木虱的基因组DNA；S2.以步骤S1的基因组DNA为模板，利用上述的6对通用引物分别进行PCR扩增反应；S3.对步骤S2的PCR扩增产物测序，然后拼接序列，即得待测木虱的线粒体基因组。优选地，步骤S2所述PCR扩增反应体系为：1μL浓度大于5ng/μL的DNA模板，0.2μM单个引物，2μL的dNTP混合液，5μL的5XPrimeSTARGXLBuffer和0.5μL的TaKaRaHSTaq，加ddH2O至总体积25μL。优选地，步骤S2所述PCR扩增反应程序为：98℃预热10s；98℃10s，48℃15s，68℃2.5min，35个循环；72℃7min；最后4℃保存。优选地，所述待测木虱为扁木虱科、个木虱科、木虱科、斑木虱科或盾木虱科中的一种。优选地，所述待测木虱为柑橘木虱、马铃薯木虱、枸杞木虱、木通红喀木虱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一套用于获取木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物，其特征在于，包括6对引物Psyllid-1、Psyllid-2、Psyllid-3、Psyllid-4、Psyllid-5和Psyllid-6，其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～12所示。/n

【技术特征摘要】
1.一套用于获取木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物，其特征在于，包括6对引物Psyllid-1、Psyllid-2、Psyllid-3、Psyllid-4、Psyllid-5和Psyllid-6，其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～12所示。


2.权利要求1所述的通用引物在获取木虱总科线粒体基因组或在制备用于扩增木虱总科线粒体基因组的试剂盒中的应用。


3.一种获取木虱总科昆虫线粒体基因组的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取待测木虱的基因组DNA；
S2.以步骤S1的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的6对引物分别进行PCR扩增反应；
S3.对步骤S2的PCR扩增产物进行测序，然后拼接序列，即可获得待测木虱的线粒体基因组。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应体系为：1μL浓度大于5ng/μL的DNA模板，0.2μM单个引物，2μL的dNTP混合液，5μL的5XPrimeSTARGXLBuffer和0.5μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴丰年，黄剑坚，吴清韩，
申请(专利权)人：韩山师范学院，
类型：发明
国别省市：广东;44