牛鞭、驴鞭与马鞭多重PCR检测试剂盒及鉴定方法技术

本发明专利技术涉及中药检测技术领域，是一种牛鞭、驴鞭及马鞭多重PCR检测试剂盒，其特征是由鉴定反应、阳性对照反应和阴性对照反应三部分体系组成。总体积为100μL，含有缓冲液，dNTP，引物1、引物2和引物3，Taq DNA聚合酶，模板DNA提取液，双蒸馏水补齐至100μL。一种牛鞭、驴鞭及马鞭多重PCR检测鉴定方法是设计合成牛鞭、驴鞭及马鞭三对特异寡核苷酸引物、确定反应程序和结果判定等步骤。判断标准：琼脂糖凝胶出现扩增长度为254bp的是牛鞭，出现扩增长度为447bp的是驴鞭，出现扩增长度为595bp的是马鞭。牛鞭、驴鞭及马鞭多重PCR检测试剂盒及鉴定方法能够同时准确区别牛鞭、驴鞭及马鞭。

【技术实现步骤摘要】
牛鞭、驴鞭与马鞭多重PCR检测试剂盒及鉴定方法
本专利技术涉及中药检测
，更具体地说，是一种牛鞭、驴鞭与马鞭DNA检测试剂盒及鉴定方法。
技术介绍
鞭类药材系指动物的带睾丸的阴茎。其味甘、咸，性温，归肝、肾、膀胱经。自古以来就是中医临床常用补肾壮阳药物，认为其对性功能障碍有明显的改善和促进作用。由于其活性强，临床疗效好，越来越引起人们的重视。运用中医学“以脏补脏”的理论,结合现代药理,人们对鞭类药材进行了深入的研究和开发,对于继承和发展祖国的性文化、食疗养生文化、促进生命科学的研究具有十分重要的现实意义。但由于鞭类药材品种较多，而且加工的过程不同，在对其真伪鉴别和质量评价工作中，尚无用化学成分为指标的科学标准加以控制，也没有比较完整的质量标准体系。近年来由于鞭类药材尤其是鹿鞭的货源紧缺、价格昂贵，致使各种伪充品层出不穷。目前对该类药材的真伪及品种的鉴定主要是靠感官，或更多利用性状或显微鉴别方法，一些新技术、新方法的应用还处于初步的探索阶段，对鞭类药材的系统研究尚不多见。近年来,以鞭类为主药的复方滋补方药日渐增多,如至宝三鞭丸、海狗丸、三肾丸等,以鞭类为主药的药粥、药膳、药酒风靡盛行,动物鞭被作为一种高档滋补品赠送亲友。牛鞭为牛科动物雄性黄牛(BostaurusdomesticusGmelin)的阴茎及睾丸。宰杀后，割取阴茎，除去残肉及油脂，风干或低温干燥。性甘、咸，温。具有补肾壮阳，固元益精，散寒止痛。主治肾阳虚衰、阳痿遗精、宫寒不孕、耳鸣腰酸、遗尿疝气。驴鞭(EquusPenisetTestis)是马科动物驴的雄性外生殖器，又名驴肾，形态似驴肉条。雄驴杀死后，割取其阴茎及睾丸，剔除残肉及油脂，洗净，悬挂于通风处阴干或晒干。是一味强筋壮骨的中药，具有益肾强筋、滋肾壮阳的功效。牛鞭与驴鞭作为药用分别始载于《本草纲目》兽部第五十卷牛项下和驴项下。牛鞭与驴鞭是归身补血片、补天灵片和参茸多鞭酒主要成分，收录于中华人民共和国卫生部药品标准(牛鞭：中药成方制剂7册39页WS3-B-1304-93；驴鞭：Z7-82WS3-B-1346-93；参茸多鞭酒：Z1-110标准编号：WS3-B-0108-89)。两种鞭类药材主要伪品为马鞭。王远志《鞭类药材的鉴定研究》(辽宁中医学院[D]，2004)首次对鹿鞭、驴鞭以及牛鞭6类鞭类药材进行了显微鉴定、横向的蛋白质电泳分析和紫外光谱分析的对比实验，通过对不同鞭类药材的电泳谱带和紫外光谱峰形上做了对比分析。尽管鉴定鞭类药材的方法拓展到了从基源，显微到理化鉴别的层面、角度，建立了比较客观的品质评价体系。但是,这些检测技术方法很难从根本上代表鞭类药材变异的遗传标记(geneticmarker)。这种状况严重制约了鞭类质量研究的进一步发展，故迄今为止还没有获得能够稳定、有效地区分牛鞭、驴鞭的特异性DNA分子标记。本专利技术人遵循动物线粒体DNA(mtDNA)作为遗传信息的载体，是研究动物起源进化及对群体进行遗传分析的理想对象，子代的mtDNA基本上都是来自卵细胞，所以mtDNA是母性遗传(maternalinheritance)，且不发生DNA重组，因此，具有相同mtDNA序列的个体必定是来自一位共同的雌性祖先。线粒体基因组作为细胞核外的遗传系统，具有完整性、多态性、自主性和小型性等特点，其进化速率是核基因的5-10倍，常用于系统发生学和群体遗传学的研究。线粒体细胞色素b(cytochrome,cytb)基因进化速度适中，是分析种内、种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA片段，可应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究。选择线粒体细胞色素b基因作为分子遗传学标记，建立多重PCR反应，为牛鞭、驴鞭鉴别提供了一条新的途径。利用多重PCR在一个反应体系中加入多对特异性引物，针对多个模板扩增多个目的片段的PCR技术，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点。
技术实现思路
本专利技术的目的是在建立牛鞭、驴鞭与马鞭线粒体DNA的基因组文库基础上，采用生物信息学技术对牛鞭、驴鞭与马鞭线粒体DNA基因组进行筛选，设计可有效地区分牛鞭、驴鞭与马鞭的特异性DNA序列，利用多重PCR技术在一个反应体系中加入三对特异性引物，针对三个模板可扩增三个具有差异的目的片段。提供一种能够准确鉴别牛鞭、驴鞭与马鞭特异性分子标志，使用方便的牛鞭、驴鞭与马鞭多重PCR检测试剂盒，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点，并提供简便、快速、检测结果可靠的鉴定方法。本专利技术的目的是由以下技术方案来实现的：一种牛鞭、驴鞭及马鞭多重PCR检测试剂盒，其特征是，它包含：(a)鉴定反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mMdNTP4-10μL，0.1mM引物1、引物2和引物3中的每种1.5-4.0μL，TaqDNA聚合酶2-10μL，待检样本DNA2-5μL，余为双蒸馏水；(b)阳性对照反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mMdNTP4-10μL，0.1mM引物1、引物2和引物3中的每种1.0-1.5μL，TaqDNA聚合酶2-10μL，牛鞭、驴鞭及马鞭DNA(1:1:1)混合物2-5μL，余为双蒸馏水；(c)阴性对照反应体系：总体系均为100μL，含有缓冲液10μL，12.5mMdNTP4-10μL，0.1mM引物1、引物2和引物3中的每种1.5-4.0μL，TaqDNA聚合酶2-10μL，猪鞭或羊鞭DNA按1：1混合2-5μL，余为双蒸馏水。牛鞭、驴鞭及马鞭多重PCR鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤：(1)设计牛鞭、马鞭及驴鞭三对特异寡核苷酸引物，如下引物1、引物2和引物3：引物1(牛鞭，扩增长度254bp)Forwardprimer：5′CATCAAACATCTCATCTTGATG3′Reverseprimer：5′AGTGTAAGACCCGTAATATAAG3′引物2(驴鞭，扩增长度447bp)Forwardprimer：5′TCGAATGAATCTGAGGTGGA3′Reverseprimer：5′ACATGTGTAGGGTAGGGATG3′引物3(马鞭，扩增长度595bp)Forwardprimer：5′GGCCTCTACTACGGCTCTTA3′Reverseprimer：5′GGATGGAGAGGATTAGGGCT3′(2)人工合成线粒体DNA三对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯法合成；(3)确定反应程序分别将牛鞭、马鞭及驴鞭基因组DNA加入PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各100μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行:94℃预变性5-7min，94℃30s，退火57℃30s，72℃1min-30s，30个循环，72℃延伸5-8min,4℃；(4)结果判定反应产物使用1.5-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛鞭、驴鞭与马鞭多重PCR检测试剂盒,其特征是，它包含：/n(a)鉴定反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP 4-10μL，0.1mM引物1、引物2和引物3中的每种1.5-4.0μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，待检样本DNA 2-5μL，余为双蒸馏水；/n(b)阳性对照反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4-10μL，0.1mM引物1、引物2和引物3中的每种1.0-1.5μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，牛鞭、驴鞭及马鞭DNA(1:1:1)混合物2-5μL，余为双蒸馏水；/n(c)阴性对照反应体系：总体系均为100μL，含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP 4-10μL，0.1mM引物1、引物2和引物3中的每种1.5-4.0μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，猪鞭或羊鞭DNA按1：1混合2-5μL，余为双蒸馏水。/n

【技术特征摘要】
1.一种牛鞭、驴鞭与马鞭多重PCR检测试剂盒,其特征是，它包含：
(a)鉴定反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mMdNTP4-10μL，0.1mM引物1、引物2和引物3中的每种1.5-4.0μL，TaqDNA聚合酶2-10μL，待检样本DNA2-5μL，余为双蒸馏水；
(b)阳性对照反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mMdNTP4-10μL，0.1mM引物1、引物2和引物3中的每种1.0-1.5μL，TaqDNA聚合酶2-10μL，牛鞭、驴鞭及马鞭DNA(1:1:1)混合物2-5μL，余为双蒸馏水；
(c)阴性对照反应体系：总体系均为100μL，含有缓冲液10μL，12.5mMdNTP4-10μL，0.1mM引物1、引物2和引物3中的每种1.5-4.0μL，TaqDNA聚合酶2-10μL，猪鞭或羊鞭DNA按1：1混合2-5μL，余为双蒸馏水。


2.牛鞭、驴鞭及马鞭多重PCR鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤：
(1)设计牛鞭、马鞭及驴鞭三对特异寡核苷酸引物，如下引物1、引物2和引物3：
引物1(牛鞭，扩增长度254bp)
Forwardprimer：5′CATCAAACATCTCATCTTGATG3′
Reverseprimer：5′AGTGTAAGACCCGTAATATAAG3′
引物2(驴鞭，扩增长度447bp)
Forwardprimer：5′TCGAATGAATCTGAGGTGGA3′
Reverseprimer：5′ACATGTGTAGGGTAGGGATG3′
引物3(马鞭，扩增长度595bp)
Forwardprimer：5′GGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明成，孙丽媛，艾金霞，高丽君，王艳双，王雪松，赵云东，
申请(专利权)人：北华大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22