本发明专利技术提供了鉴定鲟鱼性别的microRNA血清标志物、引物组、试剂盒及其应用。本发明专利技术利用高通量小RNA测序技术和microRNA芯片技术，筛选出3龄施氏鲟性腺（精巢和卵巢）差异表达miRNA种类和表达量，筛选其中36条miRNA用于筛选施氏鲟性别的血清miRNA标记物，通过常规的血清RNA抽提、cDNA的获得以及实时定量PCR等技术集合，建立了鲟鱼性别鉴定的血清miRNA标记物新方法，并在低龄的施氏鲟和西杂杂交鲟中验证，本发明专利技术方法操作简单，重复性好，是鲟鱼性别高效早期鉴定技术领域的新突破，适合推广应用，从根本上解决鲟鱼养殖产业中生产成本高、效率低等严重制约产业发展的问题。
MicroRNA serum marker, primer set, kit and its application for sex identification of sturgeon
【技术实现步骤摘要】
鉴定鲟鱼性别的microRNA血清标志物、引物组、试剂盒及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及鉴定鲟鱼性别的microRNA血清标志物、引物组、试剂盒及其应用。
技术介绍
鲟鱼是极其名贵的鱼类，由鲟鱼籽制成的鱼籽酱富含人体必需氨基酸、多种不饱和脂肪酸、维生素等物质，营养价值极高，享有“黑色黄金”的美誉，在2013年其国际售价高达每千克800-900美元，因此雌性鲟鱼比雄性鲟鱼具有更高的经济价值。目前鲟鱼养殖和鱼子酱的生产作为新兴产业，在我国发展异常迅速，据初步统计，我国鲟鱼商品鱼养殖年产量已突破2万吨，占世界鲟鱼总产量的66.17%，占养殖总产量的72.46%，俨然已经是最大的鲟鱼养殖国和主要的鱼子酱出口国，有着巨大的市场潜力。如施氏鲟(Acipenserschrenckii)是我国黑龙江水系特有珍稀名贵的大型经济鱼类。施氏鲟的人工繁育早在19世纪30年代开始，因其具有生长速度快、抗病力及适应性强等优点，上个世纪90年代以来已成为养殖鲟鱼中的杂交亲本和鱼籽酱生产的鲟鱼养殖产业中的重要养殖品种之一（Weietal.,2011）。在养殖上能够在施氏鲟早期进行性别筛选，对雌、雄群体进行定向选育，可以获得更高的经济效益。但鲟鱼雌雄个体之间在青年期甚至成年期都没有明显的第二性征，从形态上无法辨别雌雄，且性成熟时间较长。不能够依照雌雄性别分别进行集约化养殖或一定性别比例进行饲养，造成饲养过多雄性个体的资源浪费，增加了养殖成本，阻碍了鲟鱼养殖产业化的快速发展。因此，鲟鱼性别鉴定的新技术是目前鲟鱼养殖产业可持续化发展的重点关注领域。MicroRNA(miRNA)是一类长度为22bp左右、高度保守的非编码小分子RNA，主要通过与靶基因的3'末端非翻译区(3'UTR)的完全或不完全配对，降解靶基因或抑制其翻译，从而参与广泛的生命活动进程，包括生长、分化、发育、肿瘤发生和配子形成等(Ambros,2004;Ryazanskyetal.,2014)。miRNA在血清中能够长期稳定存在，不易被RNA酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等极端条件均不会造成血清miRNA的损失。更重要的是，新近研究表明血清中miRNA表达谱的变化与肿瘤的组织密切相关，能够提示肿瘤的状态，因此，miRNA作为一种有效的肿瘤标志物的新技术用于癌症的早期诊断、恶性分级、个性化诊疗和预后判断被重点关注，甚至miRNA可以作为肿瘤治疗的靶点，指导临床用药。新近研究表明miRNA靶向性别决定和分化基因在动物雌雄二型性特征形成方面发挥着精确有效的重要调控作用(Ryazanskyetal.,2014;Fernandez-Perezetal.,2018)。如在小鼠，miR-124调控精巢分化Sox9基因(SRY-boxcontaininggene9)决定卵巢细胞的命运(Realetal.,2013)；miR-202-5p/3p受上游Sox9基因的调控在精巢分化中起作用(Wainwrightetal.,2013)；miR-19a/b靶向性别决定因子Dmrt1(doublesexandMab-3relatedtranscriptionfactor1)在性逆转中发挥作用(Liuetal.,2015)。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供鉴定鲟鱼性别的microRNA血清标志物，所述的标志物为asc-miR-133-3p、asc-miR-133a-3p、asc-miR-130a-3p和dre-miR-34c的组合，各microRNA的序列为如下所示：asc-miR-133-3p：UGGUCCCCUUCAACCAGC（SEQIDNO.2）；asc-miR-133a-3p：UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG（SEQIDNO.3）；asc-miR-130a-3p：CAGUGCAAUAUUAAAAGGGCAU（SEQIDNO.8）；dre-miR-34c：AGGCAGUGCAGUUAGUUGAUUAC（SEQIDNO.11）。本专利技术的第二个目的是提供鉴定鲟鱼性别的检测引物组，包括用于检测所述的asc-miR-133-3p、asc-miR-133a-3p、asc-miR-130a-3p和dre-miR-34c的检测引物。优选，所述的asc-miR-133-3p、asc-miR-133a-3p、asc-miR-130a-3p和dre-miR-34c的检测引物为：asc-miR-133-3p的正向引物如SEQIDNO.16所示；asc-miR-133a-3p的正向引物如SEQIDNO.17所示；asc-miR-130a-3p的正向引物如SEQIDNO.18所示；dre-miR-34c的正向引物如SEQIDNO.19所示；反向引物为通用反向引物，序列如SEQIDNO.20所示。本专利技术的第三个目的是提供上述的microRNA血清标志物作为检测靶标在制备鉴定鲟鱼性别的试剂盒中的应用。本专利技术的第四个目的是提供上述的检测引物组在制备鉴定鲟鱼性别的试剂盒中的应用。本专利技术的第五个目的是提供一种鉴定鲟鱼性别的试剂盒，所述的试剂盒包括用于检测所述的鉴定鲟鱼性别的microRNA血清标志物含量的试剂。所述的试剂盒包括asc-miR-133-3p、asc-miR-133a-3p、asc-miR-130a-3p和dre-miR-34c的检测引物，具体为：asc-miR-133-3p的正向引物如SEQIDNO.16所示；asc-miR-133a-3p的正向引物如SEQIDNO.17所示；asc-miR-130a-3p的正向引物如SEQIDNO.18所示；dre-miR-34c的正向引物如SEQIDNO.19所示；反向引物为通用反向引物，序列如SEQIDNO.20所示。优选，还包括逆转录茎环引物，具体为：asc-miR-133-3p的逆转录茎环引物如SEQIDNO.12所示；asc-miR-133a-3p的逆转录茎环引物如SEQIDNO.13所示；asc-miR-130a-3p的逆转录茎环引物如SEQIDNO.14所示；dre-miR-34c的逆转录茎环引物如SEQIDNO.15所示。所述的试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。与现有技术相比，本专利技术的优势在于：本专利技术为鲟鱼性别鉴定提供了新的检测方法。与现有技术相比，本专利技术检测血浆/血清中的稳定的性别相关的microRNA，在定量测定方面，miRNA的定量灵敏度和特异性非常高，使用实时定量PCR技术，可以有效区别鲟鱼的雌雄性别。利用本专利技术的鲟鱼性别鉴定的实时定量miRNAPCR检测试剂盒的芯片方法检测，其检出率可达80%，可以有效区分未知幼龄鲟鱼样本的雌性和雄性，该鲟鱼种类不限于施氏鲟，对其它种类的鲟鱼例如西杂杂交鲟同样具有很好的检出率。此外本专利技术对鲟鱼进行性别鉴定是不需要剪取鲟鱼器官获取DNA，对鲟鱼的伤害极低。本专利技术方法操作本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.鉴定鲟鱼性别的microRNA血清标志物，其特征在于，所述的标志物为asc-miR-133-3p、asc-miR-133a-3p、asc-miR-130a-3p和dre-miR-34c；/nasc-miR-133-3p的序列如SEQ ID NO.2所示；/nasc-miR-133a-3p的序列如SEQ ID NO.3所示；/nasc-miR-130a-3p的序列如SEQ ID NO.8所示；/ndre-miR-34c的序列如SEQ ID NO.11所示。/n
【技术特征摘要】
1.鉴定鲟鱼性别的microRNA血清标志物，其特征在于，所述的标志物为asc-miR-133-3p、asc-miR-133a-3p、asc-miR-130a-3p和dre-miR-34c；
asc-miR-133-3p的序列如SEQIDNO.2所示；
asc-miR-133a-3p的序列如SEQIDNO.3所示；
asc-miR-130a-3p的序列如SEQIDNO.8所示；
dre-miR-34c的序列如SEQIDNO.11所示。
2.一种鉴定鲟鱼性别的检测引物组，其特征在于，包括用于检测权利要求1所述的asc-miR-133-3p、asc-miR-133a-3p、asc-miR-130a-3p和dre-miR-34c的检测引物；所述的asc-miR-133-3p、asc-miR-133a-3p、asc-miR-130a-3p和dre-miR-34c的检测引物为：
asc-miR-133-3p的正向引物如SEQIDNO.16所示；
asc-miR-133a-3p的正向引物如SEQIDNO.17所示；
asc-miR-130a-3p的正向引物如SEQID...
【专利技术属性】
技术研发人员：张秀娟，陈金平，吴文化，周佳滨，李林妙，江海英，
申请(专利权)人：广东省生物资源应用研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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