用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组、试剂盒及方法。该引物组包括：与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的外侧引物对F3和B3，及与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的内侧引物对FIP和BIP，用该引物组进行检测时，其检测方法具有灵敏度高、效率高、反应时间短、特异性高、操作简便、结果判定简单等优点，且广泛适用于基层。

Primer set, kit and method for lamp detection of Echinococcus granulosus in dogs

【技术实现步骤摘要】
用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组、试剂盒及方法
本专利技术属于生物
，具体涉及用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
棘球蚴病，又称包虫病，是由棘球绦虫幼虫—棘球蚴寄生于人和动物体内而引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病。棘球绦虫的成虫寄生于终宿主犬科动物的小肠内,虫体成熟后,虫卵和成熟的孕节片可随粪便排出体外。若被中间宿主(主要是啮齿类动物以及一些家畜如羊、牛、马、猪等)食入活虫卵后,形成幼虫寄生于肝脏、肺脏、腹腔等,犬又通过吞食带有幼虫的内脏而感染。犬作为包虫病的终末宿主，是该病最重要的传染源。目前，对棘球绦虫的检测主要有传统常规粪便检测法、粪抗原ELISA检测法和PCR分子生物学检测方法。常规粪便检测法繁琐费时，检出率低，且无法从犬粪便中区分细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的虫卵，存在感染操作人员的风险；粪抗原ELISA检测法和PCR均具有较好特异性和敏感性，但是费时费力、所需仪器复杂，不利于基层流行病学的调查和大量样品的检测。因此，建立一种快速、简便、灵敏的能用于细粒棘球绦虫的流行病学调查及现场诊断方法具有非常重要的意义。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组、试剂盒及方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：一组用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组，其包括：与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的外侧引物对F3和B3，及与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的内侧引物对FIP和BIP，其特征在于：所述F3和B3的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述FIP和BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。如上所述的用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物在制备检测犬细粒棘球绦虫的LAMP试剂盒或检测试剂中的应用。本专利技术还提供了含如上所述用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物的检测试剂盒。优选地，所述检测试剂盒为LAMP试剂盒，除了包含上述引物组外，还包括：环介导等温扩增缓冲液、阳性对照、阴性对照和/或显色液。所述阳性对照为犬细粒棘球绦虫DNA阳性样本或国内分离到的犬细粒棘球绦虫DNA提取样本或含SEQIDNO.5所示或COX2序列。优选地，所述环介导等温扩增缓冲液为包括有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween-20、MgSO4、甜菜碱(Betaine)、脱氧核苷酸(dNTPs)、BstDNA聚合酶的水溶液。所述显色液包括SYBRGreenI和羟甲基萘酚蓝(HNB)。进一步地，优选地，每2μl显色液所含有溶质的物质的量为：SYBRGreenI0.16μmol，羟甲基萘酚蓝0.3μmol。进一步，本专利技术还提供一种采用上述引物的快速检测犬细粒棘球绦虫的LAMP检测方法，是用如上所述的犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物对来自患病或死亡动物的待测样品DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定患病或死亡动物中是否携带犬细粒棘球绦虫；所述环介导等温扩增反应的条件为：63℃、30～60分钟。如上所述的LAMP检测方法可以通过仪器判读也可以直接检视判断样本是否含有犬细粒棘球绦虫，所述直接检视的方法为：检测时，同时设置以含犬细粒棘球绦虫的DNA为阳性对照和以水进行检测的阴性对照；观察反应后溶液，装有阳性对照的反应管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的反应管仍为棕黄色无荧光液体；如果装有待检测样品的反应管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阴性；如果装有待检测样品的反应管有亮绿色可见荧光，则说明样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阳性。具体地，如上所述采用上述引物的快速检测犬细粒棘球绦虫的LAMP检测方法，其包括如下步骤：S1、取犬粪便待检样本，提取DNA；S2、进行环介导的等温扩增，采用如上所述的引物组对提取的DNA进行扩增；S3、结果判定：通过仪器判读或通过直接检视判断样本是否含有犬细粒棘球绦虫，如果装有待检测样品的反应管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阴性；如果装有待检测样品的反应管有亮绿色可见荧光，则说明样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阳性。如上所述的LAMP检测方法，优选地，在步骤S2中，在步骤S2中，同时设置以含犬细粒棘球绦虫的DNA为阳性对照和以水进行检测的阴性对照。如上所述的LAMP检测方法，优选地，在步骤S2中，所述环介导的等温扩增的扩增体系为在有23μl的LAMP反应液的反应管中加入2μl所述DNA，2μl显色液，扩增反应是在63℃恒温30～60分钟。如上所述的LAMP检测方法，优选地，所述23μl的LAMP反应液，包括有Tris-HCl0.5μmol、KCl0.25μmol、(NH4)2SO40.25μmol、Tween-200.025μL、MgSO40.2-20μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、BstDNA聚合酶16U，所述内侧引物对FIP和BIP各0.04-0.06μmol，所述外侧引物对F3和B3各0.004-0.008μmol。进一步，优选地，所述23μl的LAMP反应液，可采用如下组份用量：Tris-HCl0.5μmol、KCl0.25μmol、(NH4)2SO40.25μmol、Tween-200.025μL、MgSO40.2μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、BstDNA聚合酶16U，所述内侧引物对FIP和BIP各0.04μmol，所述外侧引物对F3和B3各0.004μmol。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的一组用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测试剂盒，可用于检测或筛查患病或死亡动物或离体样本或饲料等样品中是否携带犬细粒棘球绦虫，其使用方便，操作简便，成本低，所需条件仅在水浴锅或金属恒温加热器即可进行。本专利技术的检测方法具有灵敏度高、效率高、反应时间短、特异性高、操作简便、安全性好、结果判定简单等优点，且广泛适用于基层。附图说明图1为犬细粒棘球绦虫LAMP检测方法的敏感性，N：阴性对照；标号1-6的溶液浓度分别为100、101、102、103、104、105copise/ml。图2为犬细粒棘球绦虫PCR检测方法的敏感性，其中，M：100bpDNALadderDNAPlusMASS(5μl)；N：阴性对照；条带1-6：LAMP反应中模板菌体含量为105、104、103、102、101、100copise/ml。图3为犬细粒棘球绦虫LAMP检测方法的特异性，其中，M：2KPlusDNAMARKER；条带1-5：分别为阴性对照，阳性对照，犬蛔虫、弓形虫、钩虫DNA。图4为犬细粒棘球绦虫PCR检测的特异性，其中，M：2KPlusDNAMARKER；条带1-5分别为阴性对照，阳性对照，犬蛔虫、弓形虫、钩虫DNA。图5为犬细粒棘球绦虫LAMP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组，其包括：与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的外侧引物对F3和B3，及与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的内侧引物对FIP和BIP，其特征在于：所述F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
20190228 CN 20191015324991.一组用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组，其包括：与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的外侧引物对F3和B3，及与犬细粒棘球绦虫的COX2基因序列结合的内侧引物对FIP和BIP，其特征在于：所述F3和B3的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述FIP和BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。


2.如权利要求1所述的用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物在制备检测犬细粒棘球绦虫的LAMP试剂盒或检测试剂中的应用。


3.含如权利要求1所述用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物的检测试剂盒。


4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其还包括：环介导等温扩增缓冲液、阳性对照、阴性对照和/或显色液。


5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增缓冲液为包括有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween-20、MgSO4、甜菜碱、脱氧核苷酸、BstDNA聚合酶的水溶液；
所述显色液包括SYBRGreenI和羟甲基萘酚蓝。


6.一种采用如权利要求1所述引物组的快速检测犬细粒棘球绦虫的LAMP检测方法，是用所述的犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组对待测样品DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物；所述环介导等温扩增反应的条件为：63℃、30～60分钟。


7.如权利要求6所述的LAMP检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、取犬粪便待检样本，提取DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑雪莹，邓柏林，吴文学，陈会玲，闫新博，宋彦军，张启龙，韦海涛，刘海莹，
申请(专利权)人：北京市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：北京;11